離體篩選茄子抗羥脯氨酸突變體的初步研究

摘要：利用體細胞無性系變異篩選茄子的抗羥脯氨酸突變體，通過建立一套茄子離體培養技術，用濃度為8 mmol·L^-1的羥脯氨酸(L-Hyp)作為篩選壓力進行離體篩選，獲得了茄子抗羥脯氨酸的愈傷組織，并再生培養成抗性植株。經耐冷性生理生化指標測定，抗性愈傷組織的脯氨酸含量與可溶性糖含量顯著地高于對照，而丙二醛含量和電導百分率卻顯著低于對照，從而具有更好的耐冷性。再生植株的幼苗葉片脯氨酸含量顯著高于對照，而電導百分率卻顯著低于對照，表現出更強的耐冷性。

關鍵詞：茄子；耐冷性；無性系變異；羥脯氨酸；突變體

中圖分類號：S541.1；Q948.112+.2；S603.6 文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0805-04

Primarily Study on In Vitro Selection of Hydroxyproline-resistant Mutants of Eggplant

ZHANG Dong-liang，XU Yue-jin，CHEN Jian-jun

(College of Horticulture and Forstry， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China)

Abstract： This study aimed to use somaclonal variation to select hydroxyproline-resistant mutants of eggplant. Through establishing the in vitro culturing procedure of eggplant， 8 mmol·L^-1 L-hydroxyproline was used as selection stress to in vitro selection the mutants. Finally， hydroxyproline-resistant calli and their regenerated plants were obtained. The hydroxyproline -resistant calli had significantly higher proline content and higher soluble sugars， while significantly lower malondialdehyde content and lower electrical conductivity compared with controls when identified with physiological and biochemical indices of cold-tolerance of eggplant. The regenerated plants had significantly higher proline content and significantly lower electrical conductivity than controls. They also exhibited stronger cold tolerance than controls.

Key words： eggplant； cold tolerance； somaclonal variation； L-hydroxyproline； mutant

近年來，隨著茄子保護地栽培面積的擴大，對專用品種的需求愈來愈強烈，但目前在茄子的栽培種中尚未尋找到耐冷性強的材料，故很難通過常規方法培育出耐冷的品種。采用體細胞融合、轉基因技術等手段已經培育出了一些耐冷的品種，無性系變異的利用也已經在一些作物上取得成功。這種變異在植物組織培養后的再生植株中常表現得很廣泛，而且變異頻率非常高。它能發生在染色體水平上，也能發生在分子水平上[1]。人們利用體細胞無性系變異結合壓力篩選已經培育出許多抗病、耐逆的品種。本研究通過建立一套茄子離體培養技術，利用體細胞無性系變異，用羥脯氨酸(L-Hyp)進行離體篩選，獲得了茄子抗羥脯氨酸的愈傷組織，并再生成抗性植株。經耐冷性生理生化指標測定，抗性愈傷組織和抗性植株表現出了更強的耐冷性。

1材料與方法

1.1材料

試驗依據茄子(Solanum melongena L.)耐冷性強弱，從本實驗室經多年培育而成的7個純合茄子自交系中選用耐冷性強、適中、較弱的3個基因型不同自交系(A-158-23-4-1，B-160-22-9-5，C-172-48-25-6)為試材，代號分別為A、B、C(表1)。

1.2方法

1.2.1體細胞無性系的建立將茄子種子浸泡24 h，用70%的酒精消毒30 s后再用0.1% HgCl2消毒3～4 min，用無菌水清洗3次之后，播于1/2 MS培養基上，置于28℃±1℃的恒溫光照培養箱內培養。經過20 d左右后，形成無菌苗。在超凈工作臺上，取其子葉，將其切成5 mm×5 mm的小塊；取其下胚軸，將其切成5 mm長的小段，播于愈傷組織誘導培養基上，培養溫度為25℃±1℃，全黑暗條件下培養。愈傷組織誘導培養基為MS+2%的蔗糖+0.65%的瓊脂，pH調為5.8，另外添加NAA和6-BA不同濃度(均為mg·L^-1)組合，它們分別為：①NAA 1.0；②NAA 1.2+6-BA 0.2；③NAA 0.2+6-BA 1.2；④NAA 2.0+6-BA 0.2；⑤NAA 0.2+6-BA 2.0；⑥6-BA 3.0。

獲得的愈傷組織在添加50 mg·L^-1檸檬酸的繼代培養基中繼代培養，其他培養成分與誘導培養基相同。愈傷組織在分化培養基上分化，分化培養基為MS+蔗糖2%+瓊脂0.65%，pH調為5.8，另外添加NAA、6-BA和AgNO₃，它們的濃度(均為mg·L^-1)組合分別為：Ⅰ，NAA 1.0；Ⅱ，6-BA 1.0+AgNO₃ 2.0；Ⅲ，NAA 0.2+6-BA 2.0+AgNO₃ 6.0；Ⅳ，NAA 0.4+6-BA 2.0+AgNO₃ 8.0；Ⅴ，NAA 0.2+6-BA 3.0+AgNO₃ 10.0；Ⅵ，NAA 0.2+6-BA 4.0+AgNO₃ 12.0。

生根培養基為MS+蔗糖2%+瓊脂0.65%，添加與不添加0.2 mg·L^-1NAA，pH調為5.8，觀察其差異。再生成功之后，將其置于溫室鍛煉1周后，洗去培養基移栽于小花盆滅菌土中，外套塑料杯保濕，培養3 d后去掉塑料杯，置于露天下培養。

1.2.2篩選壓力濃度的確定及突變體的篩選采用最佳誘導愈傷組織的方法來誘導大量的愈傷組織，一部分轉入添加有0、2、4、6、8、10、12 mmol·L^-1的羥脯氨酸繼代培養基上進行篩選，以確定篩選壓力濃度。經過篩選后成活的愈傷組織轉入沒有添加羥脯氨酸的培養基中繼代培養，然后再轉入添加有8 mmol·L^-1羥脯氨酸的篩選培養基中篩選。成活的愈傷組織取出一部分進行耐冷性鑒定，一部分進行繼代培養，另一部分轉入添加8 mmol·L^-1羥脯氨酸的分化培養基中誘導分化，形成的不定芽長到達

2 cm左右時轉接于生根培養基中生根成苗。

1.2.3抗性愈傷組織和再生植株的耐冷性鑒定以野生型愈傷組織為對照，采用磺基水楊酸法測定抗性愈傷組織的脯氨酸含量，蒽酮比色法測定抗性愈傷組織的可溶性糖含量，采用李合生的方法[2]測定抗性愈傷組織的電導百分率和丙二醛含量。以該自交系非抗性愈傷組織獲得的再生植株為對照。采用5℃下測定植株幼苗的脯氨酸含量、電導百分率的方法鑒定植株的耐冷性[3]。

2結果與分析

2.1體細胞無性系的建立

2.1.1愈傷組織的誘導和繼代誘導出來的愈傷組織可分為3類(表2)，其顏色、質地、形態和生長狀態均有明顯差異。以下胚軸為外植體時多產生第1類和第2類愈傷組織，以子葉為外植體時多產生第3類愈傷組織。不同濃度的激素配比與外植體不同基因型對愈傷組織的形成有著很大的影響[4]。0.2 mg·L^-1 NAA+2.0 mg·L^-1 6-BA組合對各種基因型的茄子外植體誘導愈傷組織比較有利，誘導出來的愈傷組織體積比較大，而且質地較緊密，有利于不定芽的分化。6-BA在促進細胞分裂的過程中作用非常明顯，隨著6-BA從0增加到2.0 mg·L^-1，所形成的愈傷組織體積不斷增大，質地也比較緊密，有利于不定芽的分化。故茄子愈傷組織的誘導受內源激素和外源激素的調控，而外源激素又需要生長素和細胞分裂素配合起來使用才能有效。

2.1.2不定芽的發生不同濃度的激素、AgNO₃、外植體基因型對愈傷組織形成不定芽的影響結果見表3。從方差分析(LSD測驗)來看，不同基因型的外植體形成的愈傷組織在添加不同配組的激素和化學試劑的培養基上的分化率呈現出顯著的差異，6-BA對茄子愈傷組織誘導出不定芽起著重要作用。AgNO₃對促進不定芽的形成也起著輔助作用，在一定范圍內，隨著AgNO₃濃度的提高，不定芽的形成率也呈逐漸升高的趨勢。

2.1.3愈傷組織的繼代茄子愈傷組織較容易褐化。添加50 mg·L^-1的檸檬酸可以有效地緩解茄子愈傷組織的褐化，但不能從根本上抑制褐化。褐化的程度與愈傷組織的生理狀態有很大的關系，生長健壯的愈傷組織褐化的速度要慢，程度要低。

2.1.4不定芽生根和移栽不定芽長到2 cm左右時，轉接在1/2 MS或在添加了0.2 mg·L^-1的NAA的1/2 MS的培養基上經過10 d左右都可以生根，隨著根的不斷生長，再經過10 d左右，根可達5 cm左右。2～3周后，植株形成的根系比較發達，選取生長健壯的再生苗，經抗寒鍛煉之后，洗去再生植株根部的培養基，移栽于裝有滅菌泥土的花盆中，在28℃左右與高濕的條件下即可培養成活。

2.2篩選壓力濃度的確定及突變體的篩選

2.2.1篩選壓力的確定用羥脯氨酸篩選抗性愈傷組織的結果見圖1。從圖中可以看出，當不添加羥脯氨酸時，愈傷組織的存活率為95%，隨著羥脯氨酸濃度的加大，存活率逐漸下降。當濃度增加到4 mmol·L^-1時，存活率為48%；當增加到8 mmol·L^-1時，存活率僅為4.3%，進一步增加到10 mmol·L^-1時，愈傷組織不能存活。當把在含有8 mmol·L^-1的羥脯氨酸存活下來的愈傷組織在此培養基上再繼代兩次，其可以存活，且存活率變化不大。因此，把向培養基中添加8 mmol·L^-1的羥脯氨酸作為篩選壓力，有望篩選到抗羥脯氨酸的突變體。

2.2.2抗性愈傷組織的篩選經過誘導的愈傷組織經繼代1次后，獲得A自交系愈傷組織3 010塊、B自交系2 930塊、C自交系2 980塊。采用一步選擇法把它們分別接種在含有8 mmol·L^-1的羥脯氨酸的培養基上進行篩選，結果A自交系有31塊存活，B自交系有9塊存活，C自交系有6塊存活。然后分別把存活下來的3個自交系的愈傷組織再轉接在沒有添加羥脯氨酸的培養基上后，有些愈傷組織的生長速度下降，逐漸褐化死亡。再分別把該愈傷組織轉接含有8 mmol·L^-1的羥脯氨酸的培養基上，以排除殘存的野生型愈傷組織。結果獲得了A自交系抗性愈傷組織17塊，分別取名為HRa1、HRa2、HRa3、……、HRa17，野生型愈傷組織記作Wa；B自交系抗性愈傷組織5塊，分別取名為HRb1、HRb2、HRb3、HRb4、HRB₅，野生型愈傷組織記作Wb；C自交系抗性愈傷組織2塊，分別取名為HRc1和HRc2，野生型愈傷組織記作Wc。存活下來的抗性愈傷組織經轉接在繼代培養基上進行培養，生長良好，且繼代抗性愈傷組織對8 mmol·L^-1的羥脯氨酸具有很好的抗性，從而說明其抗性是穩定的。

2.2.3抗性植株的獲得把抗性愈傷組織轉接于含有8 mmol·L^-1的羥脯氨酸的分化培養基上，結果獲得A自交系5株苗，它們分別由抗性愈傷組織HRa3、HRa7、HRa8、HRa11分化而來(其中HRa3、HRa7和HRa8各分化出1株苗，HRa11分化出2株苗，其他抗性愈傷組織沒有得到植株)，分別記作HRPa3、HRPa7、HRPa8、HRPa11-1、HRPa11-2，野生型植株記作為WPa；獲得B自交系2株苗，它們分別由抗性愈傷組織HRb2和HRB₅分化而來，分別記作HRPb2和HRPB₅，其他抗性愈傷組織沒有得到植株，野生型植株記作為WPb；獲得了C自交系1株苗，由抗性愈傷組織HRc1分化而來，記作HRPc1，另外1塊抗性愈傷組織沒有得到植株，野生型植株記作為WPc。對照卻不能在含有8 mmol·L^-1的羥脯氨酸的分化培養基上分化出不定芽。然后我們分別對獲得的抗性植株進行擴繁。

2.3抗性愈傷組織耐冷性鑒定

從表4可以看出，抗性愈傷組織比對照有著較高的脯氨酸和可溶性糖含量，而有著較低的丙二醛含量和更低的電導百分率，并且抗性愈傷組織與它們的對照之間的差異均達到了顯著水平，似乎可以推測抗性愈傷組織比對照有著更強的滲透調節能力，且其細胞膜更穩定，表現出更強的耐逆性。

2.4抗性植株耐冷性鑒定

從外形上觀察，抗性植株和對照之間沒有明顯差異，經茄子耐冷性生理生化指標檢測，結果表明兩者之間有著顯著的差異。從表5中可以看出，抗性植株脯氨酸含量為對照的1.40～2.57倍，有了顯著的增加，而各種突變體的增幅各不一樣，但與對照之間差異達極顯著水平。抗性植株電導百分率為對照的0.54～0.93倍，相對各自與對照減少的幅度大小不同，同樣與對照之間的差異達極顯著水平。從以上結果可以看出，同一塊愈傷組織分化出來的植株抗性水平也不同，可能其基因表達調控發生了改變。從抗性植株的生理生化指標可以看出，抗性愈傷組織的抗性仍然在植株水平上得到了很好的體現，并且其抗性是一致的，故有望獲得抗性穩定遺傳的植株。通過比較其愈傷組織和植株水平的脯氨酸含量，發現在愈傷組織中脯氨酸水平要高，可能是外植體在剛脫離植物體時，其積累了大量的脯氨酸之故導致的。

3小結與討論

茄子雖然是草本植物，但是卻偏木質化，故它是一種比較難得進行組織培養的作物。相對于茄科中的番茄、馬鈴薯和煙草等來說，其再生的頻率遠遠偏低，主要原因為不定芽的發生較為困難。在試驗過程中，應該先將茄子種子進行溫湯浸種，再結合酒精和升汞消毒效果較好。升汞消毒時間保持在3～4 min即可。

茄子的愈傷組織的獲得相對簡單，下胚軸、子葉和真葉都可獲得愈傷組織，尤其是以下胚軸作為外植體來誘導愈傷組織比較容易。在本試驗中，愈傷組織的誘導率與外植體基因型和外源生長調節劑之間有著很大的關系。相對較難的是愈傷組織的繼代，因為茄子愈傷組織很容易褐化，一旦發生褐化，即使進行轉移，或在培養基中添加褐化抑制劑，也很難從根本上阻止其進一步褐化。筆者認為防止茄子愈傷組織褐化的關鍵是使它處于良好的生理狀況。生理狀態又與培養基的類型和成分以及其生長的外在環境有著很大的關系。所以，選擇好的繼代培養基和探尋其生長的環境顯得非常重要。

茄子不定芽的分化一直以來都是我們非常關注的一個問題。在利用生物技術對茄子進行遺傳改良的過程中，人們希望茄子的分化率要高，出芽的速度要快。國內外的研究者利用TDZ、ZT等生長調節劑進行誘導不定芽的分化取得了成功[5]，但是TDZ和ZT非常昂貴，增加了試驗成本。本試驗采用6-BA和NAA進行誘導不定芽的分化，成本較低，而分化率較高，但對基因型比較依賴。2～4 mg·L^-1的6-BA對不定芽的誘導比較有利，對于某些基因型來說濃度再高一點又會使分化率下降，故6-BA在一定濃度范圍內才有效果。近年來，許多研究者將具有乙烯作用的抑制劑硝酸銀應用于植物(尤其是蕓薹屬)的遺傳轉化，可以提高外源基因的轉化效率，一般認為硝酸銀可促進這些植物的不定芽的分化[6]。在本試驗中，也確實觀察到AgNO₃可以提高茄子的分化率，故可以利用增加AgNO₃的濃度來促進不定芽的分化。

羥脯氨酸作為脯氨酸的類似物，能夠與脯氨酸競爭性地反饋抑制脯氨酸合成途徑中的谷氨酸激酶(GK酶)。在抗性系細胞中可能由于編碼脯氨酸合成途徑中的第1個酶(GK酶)的ProB基因發生了突變，使GK酶對末端產物反饋抑制不敏感。基因的突變可能造成GK酶或其他相關酶活性的增加，使得細胞內游離脯氨酸含量比敏感型高。Dorffling等正是通過組織離體培養，以脯氨酸的類似物羥脯氨酸為選擇壓力獲得了小麥變異系[7]，并對其遺傳穩定性進行了分析，發現耐冷性直至自交4代仍能穩定地遺傳。遺傳分析表明，變異系抗寒性較親本增強，其自交F2家系的抗寒性與其脯氨酸含量兩性狀都呈3∶1分離規律，變異系自交后代的抗寒性在F4代仍穩定遺傳，故認為其抗寒性增強是由單個非完全顯性基因所控制。但變異體普遍存在著育性下降甚至不育、有性后代抗寒性下降等現象。林定波用γ-射線誘變與高濃度羥脯氨酸離體選擇相結合的方法，獲得了抗寒錦橙懸浮細胞系，并再生出植株[8]。本試驗通過羫脯氨酸篩選獲得了抗性愈傷組織，繼而再生成植株，且利用茄子耐冷性生理生化鑒定指標，通過測定抗性愈傷組織和其再生植株幼苗的脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量和電導百分率等指標，結果顯示其抗性愈傷組織和其再生植株的脯氨酸含量和可溶性糖含量比它們的對照有了很大的增加，而電導百分率和丙二醛含量比它們的對照有了較大的減少，初步可以認為它們之間在愈傷組織階段和幼苗階段的耐冷性有著顯著的差異。抗性的指標很多，其中游離脯氨酸含量的增加是植物對環境脅迫表現最為突出的一種生理反應，在這一點上，我們和其他作者的研究結果一致。但為什么獲得的同一自交系抗性愈傷組織的抗性水平不同，可能是其遺傳物質發生了變化，或是植物表達調控的方式發生了改變而導致酶活性的改變，從而使其抗性發生了變化。

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