苯巴比妥人工免疫原合成及抗體特性研究

摘要：將苯巴比妥(PB)經(jīng)硝化和還原兩步化學(xué)修飾后，在其苯環(huán)上引入活性基團氨基，合成具有半抗原結(jié)構(gòu)特征的對氨基苯巴比妥(pAPB)；用重氮化法將pAPB偶聯(lián)于載體蛋白BSA和OVA上，合成人工免疫原BSA-pAPB和包被抗原OVA-pAPB，用紅外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE進行鑒定，推算分子結(jié)合比；用BSA-pAPB免疫新西蘭白兔和SPF雛雞，間接ELISA測定多克隆抗體(pAb)效價，阻斷ELISA鑒定其敏感性，WestGold層析試驗和交叉反應(yīng)試驗鑒定其特異性。結(jié)果表明，BSA-pAPB偶聯(lián)成功，分子結(jié)合比為1∶19；獲得了高價、敏感、特異的pAb，為PB殘留免疫學(xué)檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苯巴比妥；半抗原；人工免疫原；抗體；鑒定

中圖分類號：S859.79+1；S852.4+3；TS201.6 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114(2008)07-0815-04

Study on Synthesis of Artificial Immunogen and Characteristics of Polyclonal Antibody of Phenobarbital

ZHANG Hai-tang，WANG Zi-liang，WANG Yan-rong，ZHONG Hua，F(xiàn)AN Guo-ying

(College of Animal Science， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003，Henan， China)

Abstract： The active group amido was introduced into phenyl of PB and formed p-amidophenobarbital(pAPB) which had hapten structure by chemical modification of nitration and deoxidization. Diazotization was used to conjugate pAPB to carrier protein BSA and obtained artificial immunogen BSA-pAPB， the coating antigen OVA-pAPB was obtained in the same way. IR， UV and SDS-PAGE were used to identify PB artificial immunogen. New Zealand white rabbits and SPF chickens were immunized with BSA-pAPB， the titre of polyclonal antibody(pAb) was measured by indirect ELISA， the sensitivity of the pAb was identified by blocking ELISA and the specificity of pAb was identified by experiments of WestGold immuno chromatography and cross-reaction. The results showed that PB artificial immunogen was synthesized successfully and its conjugation ratio of pAPB to BSA was about 19∶1， the high-titer， sensitive and specific PB pAb were produced in sera of Balb/C mice immunized with BSA-pAPB， which made it possible to establish immunoassay of PB residues in animal food.

Key words： phenobarbital； hapten； artificial immunogen； antibody； identification

苯巴比妥(Phenobarbital，PB)又名魯米那(Luminal)、迦地那(Gardenal)，主要成分為5-乙基-5-苯基-2，4，6-(1H，3H，5H)嘧啶三酮，是5位被乙基和苯基雙取代的丙二酰脲衍生物。由于PB具有鎮(zhèn)靜、催眠等特殊的生物學(xué)功能，在動物生產(chǎn)中常被用作促生長飼料添加劑[1]。但PB存在致畸、致癌等毒性作用，其殘留嚴(yán)重危害人的健康，世界各國均嚴(yán)禁PB用于食品動物[2]。PB殘留免疫學(xué)檢測方法以靈敏、準(zhǔn)確、快速、特異等優(yōu)點替代了傳統(tǒng)的理化檢驗方法[3]，德國Dade Behring公司已開發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品，國內(nèi)尚未見報道。PB半抗原和人工免疫原的合成及高價、敏感、特異抗體的獲得是建立免疫學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)，本試驗通過上述內(nèi)容的研究，旨在為PB殘留免疫學(xué)檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與溶液PB(Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)為Pierce公司產(chǎn)品；弗氏佐劑FCA、FIA(Gibco公司)；Sephadex G-25(Pharmacia公司)；對硝基苯巴比妥(pNPB)、對氨基苯巴比妥(pAPB)、羊抗鼠酶標(biāo)二抗(GaMIgG-HRP)均為本實驗室制備；其他試劑市售所得，AR級。ELISA所用洗液(PBST)為0.01 mol·L^-1、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，含0.05%Tween-20；包被液為0.1 mol·L^-1、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)；封閉液、稀釋液為含5%豬血清的PBST；酶底物為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的磷酸-檸檬酸緩沖液；終止液為2 mol·L^-1的硫酸溶液。

1.1.2主要儀器U-3000紫外掃描儀(UV，日本島津公司)；Nexus-670型紅外光譜儀(IR，Nicolet公司)；550型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件(Syngene公司)；JM-250電泳儀(大連捷邁科貿(mào)有限公司)。

1.1.3試驗動物2.5月齡、體重1.8～2.0 kg的新西蘭白兔5只；SPF 級4周齡公雛雞15只，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

1.2方法

1.2.1PB半抗原的合成硝化反應(yīng)引入硝基，取1 mmol PB，加入5 mmol HNO₃和5 mmol H2SO₄混酸溶液，55℃密閉反應(yīng)1 h，加入4倍ddw，5 000 r·min^-1離心5 min，沉淀物干燥備用，產(chǎn)物為pNPB；之后，還原反應(yīng)引入氨基，取1 mmol pNPB溶解于10 mL的 1 mol·L^-1 HCl中，加入Zn粉3 mmol，65℃密閉反應(yīng)40 min，用ddw洗滌3次，5 000 r·min^-1離心5 min，沉淀物溶解于10 mL二甲基甲酰胺(DMF)，再加入100 mL ddw，5 000 r·min^-1離心10 min，沉淀物干燥備用，產(chǎn)物為pAPB。合成路線見圖1。

1.2.2人工免疫原的合成采用改進后的逆式重氮化法[4]合成人工免疫原BSA-pAPB。取50 mg

pAPB，溶于1 mL的 1 mol·L^-1 NaOH溶液中，加入100 mg NaNO2，冰浴條件下用1 mol·L^-1的HCl調(diào)pH值為1，密閉，避光，4℃攪拌反應(yīng)6 h；加入預(yù)冷的20 mg BSA 為0.01 mol·L^-1、pH7.4的PBS溶液，4℃攪拌反應(yīng)12 h。反應(yīng)液用葡聚糖凝膠Sephadex G-25過柱純化，TLC監(jiān)測，收集Rf=0.12組分，制得人工免疫原BSA-pAPB，凍干-20℃保存?zhèn)溆谩：铣陕肪€見圖2。同法制得包被抗原OVA-pAPB。

1.2.3人工免疫原的鑒定①IR鑒定。取BSA-pAPB 2 mg，加入干燥的KBr約200 mg，置于瑪瑙乳缽中，在紅外燈照射下研磨、混勻，裝入壓片模具，8 t壓力下10 min，制得厚度1 mm的透明KBr樣品片，上機測試。②UV鑒定。用PBS配制pAPB和BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，取BSA-pAPB溶于PBS，用Braford法[5]測定其蛋白質(zhì)的濃度，據(jù)此濃度調(diào)節(jié)BSA-pAPB溶液中蛋白質(zhì)的濃度與BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，在波長200～350 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，參照楊利國[6]所述方法計算BSA與pAPB的分子結(jié)合比。③SDS-PAGE鑒定。選擇濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，濃縮膠電壓為120 V，分離膠電壓為60 V，用考馬斯亮藍(lán)染色，用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件估算BSA與pAPB的分子結(jié)合比[7]。

1.2.4PB多克隆抗體(pAb)制備用BSA-pAPB免疫兔5只、雞15只，免疫劑量兔每只500 μg·2.5 mL^-1、雞每只150 μg·mL^-1，頸部皮下分4～6點注射。首免用滅菌PBS溶解BSA-pAPB，與等量FCA混合乳化；加強免疫用滅菌PBS溶解BSA-pAPB，與等量FIA混合乳化，首免后15 d進行，共免7次，每次間隔15 d，最后一次免疫后10 d，從兔耳靜脈、雞翅靜脈采血，間接ELISA測定效價，選擇效價最高的兔和雞各2只(編號為Ⅰ、Ⅱ號兔，Ⅰ、Ⅱ號雞)心臟采血，分離血清，飽和硫酸銨鹽析法純化[8]，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PB pAb特性鑒定①效價測定用間接ELISA[9]。②敏感性鑒定用阻斷ELISA[9]，測定PB pAb對不同濃度PB的抑制率B/B0%(B是不同PB濃度的A450nm值，B0是PB0濃度的A450nm值)，以B/B0%為縱坐標(biāo)，以不同PB濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制抑制曲線，推導(dǎo)回歸方程，計算50%抑制濃度(IC50)，以IC50作為敏感度。③特異性鑒定，做2個試驗。一個是WestGold試驗，將BSA-pAPB、OVA-pAPB、BSA、OVA用點膜儀噴布于NC膜上，呈10 mm×1 mm條狀，37℃固定15 min，加入PB pAb金標(biāo)溶液，室溫反應(yīng)10 min，PBST充分洗脫后觀察結(jié)果。另一個是交叉反應(yīng)試驗：選擇PB及其PB同系物PB類、結(jié)構(gòu)相似物巴比妥類、功能近似物鎮(zhèn)靜類等作為抑制劑，用阻斷ELISA測定各競爭物的IC50，以PB pAb對PB的IC50與各競爭物的IC50百分比為其交叉反應(yīng)率(CR%)。

2結(jié)果與分析

2.1人工免疫原鑒定結(jié)果

2.1.1IR鑒定鑒定結(jié)果見圖3，將BSA-pAPB的IR與BSA的IR相比較，它們在2 500～3 200 cm-1和1 660～1 500 cm-1區(qū)域具有相似的吸收，這是BSA中氨基酸產(chǎn)生的特征峰，說明合成的BSA-pAPB中確實含有BSA；再將BSA-pAPB的IR與pAPB的IR相比較，它們在1070 cm-1處具有相似的吸收，而BSA在此處無吸收，這是重氮鹽中N=N鍵的伸縮震動產(chǎn)生的特征峰[10]，說明在BSA-pAPB中有pAPB存在。據(jù)此可以確定BSA-pAPB偶聯(lián)成功。

2.1.2UV鑒定鑒定結(jié)果見圖4，BSA的最大吸收峰在280 nm，pAPB的最大吸收峰在264 nm，BSA與pAPB偶聯(lián)后，兩者的峰疊加并位移至268 nm，表明偶聯(lián)成功；依據(jù)朗伯-比爾定律，推算出BSA-pAPB的分子結(jié)合比為1∶19.7，與Kimiko等的報道非常接近[11]。

2.1.3SDS-PAGE鑒定結(jié)果見圖5，BSA的泳動速度大于BSA-pAPB，說明BSA-pAPB的分子量大于BSA，證明pAPB與BSA已成功偶聯(lián)；用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件分析得出，BSA-pAPB的分子量為7.09×104，BSA的分子量為6.62×104，BSA與pAPB的分子結(jié)合比約為1∶19.3，與UV鑒定結(jié)果基本一致。

2.2PB pAb鑒定結(jié)果

2.2.1效價測定結(jié)果見圖6，免疫效果最好的2只兔和2只雞的pAb效價均達(dá)到了10-4，說明獲得了較好的免疫效果，其中2號兔PB pAb效價最高為1∶2.43×105。

2.2.2敏感性鑒定結(jié)果見圖7，PB在0.625～320 μg·L^-1范圍內(nèi)，4只免疫動物均產(chǎn)生了較好的抑制效果，其中2號兔線性回歸方程為y=-30.621x+85.15，R2=0.992 4，符合線性關(guān)系的判定標(biāo)準(zhǔn)。從曲線可以計算出2號兔的IC50為14.1 μg·L^-1，選擇2號兔的PB pAb進行特異性鑒定。

2.2.3特異性鑒定①WestGold試驗，結(jié)果見圖8。BSA-pAPB、OVA-pAPB和BSA位置均出現(xiàn)明顯的棕紅色條帶，OVA無條帶出現(xiàn)，說明pAb中含有針對pAPB和BSA的抗體。②交叉反應(yīng)試驗，結(jié)果見表1。表1表明，PB的IC50為14.1 μg·L^-1，說明PB與其pAb能夠特異性結(jié)合；與pNPB和pAPB具有很強的交叉反應(yīng)，這是因為PB、pNPB、pAPB具有相同的抗原表位；與巴比妥的CR%為12.4%，與其他巴比妥類藥物和鎮(zhèn)靜類藥物的CR%小于0.5%。

3討論

3.1關(guān)于PB半抗原的設(shè)計

以Landsteiner[12]創(chuàng)立的小分子半抗原與大分子載體交聯(lián)合成完全抗原理論為基礎(chǔ)，作為完全抗原其結(jié)構(gòu)必須同時具備T、B兩種細(xì)胞表位，小分子化合物由于其結(jié)構(gòu)簡單難以同時擁有兩種表位，必須將其連接到大分子蛋白質(zhì)載體上，借助載體蛋白的T細(xì)胞表位間接誘導(dǎo)B細(xì)胞激活，分化增殖，產(chǎn)生針對小分子半抗原的特異性抗體。PB是小分子化合物，結(jié)構(gòu)簡單，分子量小(232.12)，沒有可供化學(xué)偶聯(lián)利用的活性基團，對PB進行化學(xué)修飾引入活性基團氨基，通過重氮化反應(yīng)引入偶氮鍵(-N=N-)作間隔臂。間隔臂的引入遵循3個原則：①引入后不產(chǎn)生新的抗原決定簇，避免引起交叉反應(yīng)；②性質(zhì)穩(wěn)定，長度適宜，免疫原性增強，足夠刺激免疫動物產(chǎn)生抗體；③修飾過程中的化學(xué)反應(yīng)簡單易行。據(jù)此，在充分分析PB化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，選擇PB苯環(huán)對位作為偶聯(lián)位點，引入活性基團氨基作為間隔臂，經(jīng)硝化和還原兩步化學(xué)反應(yīng)合成半抗原pAPB。

3.2關(guān)于PB人工抗原的制備方法

對于帶有氨基的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)，一般采用重氮化法和戊二醛(GA)法，本研究對這兩種方法進行了比較，結(jié)果表明重氮化法優(yōu)于GA法，進一步證實了重氮化法適用于芳香胺、而GA法適合于脂肪胺的報道[13]。重氮化反應(yīng)是在pH值為1、0～4℃條件下進行的，由于半抗原pAPB不溶于酸而溶于堿，本研究先將pAPB加熱溶解于1 mol·L^-1 NaOH，再用1 mol·L^-1 HCl調(diào)節(jié)pH值并預(yù)冷之后進行，筆者稱之為逆式重氮化。重氮化的實質(zhì)是半抗原通過偶氮鍵與載體蛋白中酪氨酸、色氨酸、組氨酸的殘基形成共軛大π鍵相連，偶聯(lián)物含有發(fā)色團，溶液呈黃色，由此可判斷偶聯(lián)是否成功。

3.3關(guān)于PB人工抗原的鑒定方法

鑒定小分子人工抗原常用的方法有UV、IR、SDS-PAGE、核磁共振碳譜(C13-NMR)、標(biāo)記抗原示蹤法等。IR和C13-NMR可準(zhǔn)確測定待測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但試驗者必須具備一定水平的圖譜分析知識和操作經(jīng)驗，且費用較高；標(biāo)記抗原示蹤法需要對半抗原進行標(biāo)記，并需要測定結(jié)合半抗原的放射強度，試驗繁瑣費時。因此，根據(jù)本試驗結(jié)果，筆者認(rèn)為，UV和SDS-PAGE是目前鑒定人工抗原較為適用的方法。

3.4關(guān)于PB pAb的特性

抗體的特性主要體現(xiàn)于抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合容量、親和性和選擇性3個方面，結(jié)合容量大小以效價來表示，在試驗中采用間接ELISA測定，以2號兔效價最高，達(dá)到1∶6.4×106；親和性通常以親和常數(shù)(Ka)表示，但由于pAb的親和性不均一，難以測得準(zhǔn)確的Ka值，在試驗中以敏感性衡量其親和性，試驗結(jié)果表明，2號兔產(chǎn)生的pAb親和性最好，IC50為14.1 μg·L^-1；選擇性是由抗體的特異性所決定的，試驗采用瓊脂雙擴散試驗、WestGold蛋白質(zhì)膜印跡試驗和交叉反應(yīng)試驗鑒定其特異性，3種試驗方法所得結(jié)果基本一致，2號兔產(chǎn)生的pAb具有較好的特異性。

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