草魚腸炎病病原菌的分離鑒定

摘要：根據(jù)患病草魚(Ctenopharyngodon idellus)的臨床癥狀，解剖分析，初步判斷為草魚腸炎病。為確診該病，從患病草魚采集組織進行實驗室檢查，分離得到病原菌CQWL001，按常規(guī)方法進行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、主要生化及動物試驗，確定該病的病原菌為腸型點狀氣單胞菌。

關(guān)鍵詞：草魚；腸型點狀氣單胞菌；分離；鑒定

中圖分類號：S943.112文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0824-02

草魚腸炎病是一種由致病菌引起的常見傳染病，發(fā)病頻率很高，對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害特別嚴重[1]。已有研究表明，引起草魚腸炎疾病的細菌主要為氣單胞菌屬，包括嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌，單獨或混合感染引發(fā)腸炎[2]。本研究對臨床癥狀為腸炎的草魚進行解剖，分離后得到1株草魚腸炎病病原菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、染色特性、生化試驗等方法對其進行鑒定，并對其進行了人工回歸感染試驗，旨在初步弄清草魚腸炎病病原菌的菌屬問題，為診斷和防治該病提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

患腸炎病草魚取自重慶市永川區(qū)雙竹漁場，帶回實驗室進行分離培養(yǎng)。健康草魚購自重慶市永川區(qū)雙竹漁場，平均體重為35±5 g，在實驗室內(nèi)馴養(yǎng)1周后用于試驗。馴養(yǎng)和試驗期間，每日以自制人工餌料喂食1次，養(yǎng)殖用水為曝氣6 d的自來水，pH 值7.2，水溫22±1℃，溶氧7.3～8.1 mg·L^-1。腸桿菌科細菌生化鑒定管及其他細菌生化鑒定所需試劑購自中國人民解放軍浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢驗所；常規(guī)藥品均為本實驗室自備。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離純化無菌條件下解剖瀕臨死亡的患腸炎病的草魚，采集病魚鰓、肝、腎和腹水，用研缽碾碎組織并制成組織懸液，挑取組織懸液在普通瓊脂平板上劃線，37℃培養(yǎng)過夜，挑選形態(tài)結(jié)構(gòu)、顏色相同的單個菌落，在平板上再次劃線分離純化。斜面中生理鹽水保存4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原菌的形態(tài)學(xué)觀察觀察分離純化的菌落形態(tài)并進行涂片，革蘭氏染色，硝酸銀鞭毛染色，光學(xué)顯微鏡觀察。用標準測微尺測定病原菌大小。

1.2.3病原菌的鑒定將分離純化的病原菌接種于各種鑒定試劑管和配置的營養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)，根據(jù)標準管比較觀察結(jié)果。病原菌鑒定參考伯杰氏(Bergey’s)細菌鑒定手冊[3]。

1.2.4人工感染試驗將試驗魚放在1.0 m×0.6 m×0.8 m的水族箱中馴養(yǎng)，在其胸鰭基部注射濃度為106 CFU·mL^-1的純菌液，飼養(yǎng)96 h后，觀察受試魚的致病癥狀，并進行病理檢查。

1.2.5病原菌的毒力測定將分離純化的病原菌接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，采用紫外分光光度計測定病原菌濃度。按照等對數(shù)間距法將菌液濃度稀釋為10⁵、10⁶、10⁷、10⁸和10⁹ CFU·mL^-1 5個濃度梯度試驗組，每組草魚10尾，每尾魚腹腔注射0.5 mL菌液，對照組每尾魚注射等量無菌生理鹽水，3個重復(fù)。在1.0 m×0.6 m×0.8 m的水族箱中飼養(yǎng)觀察96 h，試驗期間不投餌，并及時清污。記錄發(fā)病癥狀及死亡情況，按Karber統(tǒng)計法計算96 h LC50。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

從患腸炎病草魚中分離出致病菌CQWL001。普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的菌落，灰白色、半透明、光滑、濕潤。該病原菌在革蘭氏染色后顯微鏡觀察為革蘭氏陰性、短桿狀細菌，大小為0.3～0.4×0.6～0.9 μm，無芽孢(圖1)。

2.2病原菌的生化鑒定

病原菌生化鑒定試驗檢測了10種糖，其中棉子糖、鼠李糖、木糖、乳糖顯陰性，其他均顯陽性。而檢測的甘露醇、衛(wèi)矛醇、肌醇、山梨醇、側(cè)金盞醇5種醇，除了甘露醇顯陽性以外，其余均顯陰性。其他檢測指標都為陽性(表1)。根據(jù)伯杰氏(Bergey’s)細菌鑒定手冊，鑒定分離出來的草魚腸炎病致病菌為腸型點狀氣單胞菌。

2.3感染試驗

病原菌毒力試驗結(jié)果顯示，注射病原菌的草魚均在96 h內(nèi)發(fā)病，染病草魚精神委靡，游動緩慢，懶散，厭食。外觀檢查發(fā)現(xiàn)病魚腹部膨脹，肛門紅腫、外凸。解剖檢查，病魚輕微腹水，腸道發(fā)炎，腸壁充血，腸腔內(nèi)有淡黃色黏液。此癥狀與所收集的腸炎病草魚癥狀基本一致?；厥詹≡?，其形態(tài)、染色特性、生化特性與自然病例分離的致病菌相同。

2.4分離菌株的毒力

草魚感染腸炎病致病菌96 h后的致死情況如表2 所示。經(jīng)病理檢查，試驗過程中死亡的病魚均出現(xiàn)腸炎病的癥狀，因此確定為腸型點狀單胞菌感染致死。采用Karber法計算半致死濃度，獲得腸型點狀氣單胞菌對草魚的96 h LC₅₀為10⁶ CFU·mL^-1。

3討論

從患病草魚組織內(nèi)分離出來的致病菌CQWL001，經(jīng)形態(tài)學(xué)、染色特性和生化試驗，檢索伯杰氏細菌鑒定手冊，鑒定為腸型點狀氣單胞菌。本試驗首先采用腸桿菌科細菌生化鑒定管進行鑒定，得出初步結(jié)果后再作進一步鑒定。生化鑒定結(jié)果及病原菌形態(tài)特性與李軍等[4]的研究結(jié)果相一致。

腸型點狀氣單胞菌為條件性致病菌，廣泛存在在水體和淤泥中，具有很強毒力，腹部注射96 h后LC₅₀為10⁶ CFU·mL^-1。草魚處在良好環(huán)境及健康狀態(tài)時，魚體內(nèi)的腸型點狀氣單胞菌未能迅速繁衍，故無發(fā)病癥狀。當水環(huán)境發(fā)生改變(如水質(zhì)惡化、溶氧低、氨氮高等)時則引起魚的抵抗力下降，該病原菌便會在腸內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致腸炎病爆發(fā)。本研究分離純化的病原菌能使草魚感染，其發(fā)病癥狀與自然發(fā)病的癥狀相同，并可引起死亡。從病死草魚的組織中回收到與分離病原菌相同的細菌，說明該分離菌是引起草魚腸炎發(fā)病死亡的病原菌。

草魚腸炎病對養(yǎng)殖生產(chǎn)危害較大，草魚腸炎病病原菌的分離與鑒定，有利于養(yǎng)殖水產(chǎn)疾病的診斷和預(yù)防。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，對草魚腸炎病主要的防治措施有西藥治療、中藥治療以及綜合防治等。筆者提倡采用綜合防治措施，并建議在用藥前對病原菌進行分離和藥敏測定后選擇敏感藥物使用[5]。

參考文獻：

[1]徐伯亥，熊木林，韓先樸，等.二齡草魚腸炎病的研究[J]. 水生生物學(xué)報，1987，11(1)：73-82.

[2]陳翠珍，張曉君，房海.草魚腸炎的病原菌檢驗與分析[J].中國獸醫(yī)科技，1999，29(1)：5-7.

[3]布坎南 R E.伯杰細菌鑒定手冊(第8版)[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

[4]李軍，閔正沛，徐伯亥，等.草魚腸型點狀氣單胞菌的分離和鑒定[J].水利漁業(yè)，2007，27(2)：107-108.

[5]張曉君，陳翠珍，房海.草魚腸炎嗜水氣單胞菌分離株的主要特性及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2006，22(4)：334-338.