黃粉蟲蛹超氧化物歧化酶的提取及性質研究初報

摘要：以黃粉蟲蛹凍干粉為研究材料，獲得了一種超氧化物歧化酶(SOD)，PAGE法顯示為均一的蛋白譜帶。通過在相同時間內，不同pH值、溫度對酶的影響，結果表明，意大利蜂蛹中SOD在相同的時間內，pH值為8.35時，有最大的酶活力，pH值高于或低于8.35，酶活力均明顯下降；溫度在25.5℃左右酶活力最高，40℃時保持活力80%以上，到90℃時沒有活力。

關鍵詞：黃粉蟲蛹；超氧化物歧化酶(SOD)；提取工藝；性質

中圖分類號：Q554+.9文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0828-02

Extraction and Characteristics of SOD from the Pupae of Tenebrio molitor L.

DU Kai-shu，L Wen-yan，CHAI Li-ying

(Department of Sources and Environment， Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China)

Abstract： In the paper， freeze-drying pupae of Apis mellifer was used as experimental material based on former studies. The purified superoxide dismutase (SOD) was obtained. The analysis with PAGE electropherogram showed that it was a homogeneous protein. The result of the influence of enzyme at the different pH and temperature at the same time showed that the superoxide dismutase would keep the most activity at pH 8.35， and the activity came down；it kept the most activity at the 25.5℃， remain 80% enzyme activity at the 40℃， but lost activity in the 90℃.

Key words： pupae of Tenebrio molitor L.；superoxid dismtase；extraction

超氧化物歧化酶(SOD，EC1.15.1.1)是一類催化超氧陰離子自由基(O2-)發生歧化反應的金屬酶。根據所含金屬離子的不同，可將SOD分為Cu/Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD[1]，最近又發現一種Ni-SOD[2，3]。到目前為止，國內外對SOD的分離純化、生理功能、基因的表達調控、結構研究及其應用已諸多報道，并已從植物、動物、微生物等多種生物材料中分離純化到超氧化物歧化酶。目前黃粉蟲因其含有硒、鋅和錳等多種具有抗氧化性的微量元素、維生素及氨基酸，現作為一種資源昆蟲得到廣泛應用。但究竟是哪些活性物質具有保健作用以及如何發揮作用，到目前還沒有統一的結論。因此研究黃粉蟲蛹中SOD的性質，有助于深入了解黃粉蟲蛹抗氧化和防衰老等作用機理。

1材料與方法

1.1材料

黃粉蟲蛹為河南科技學昆蟲實驗室飼養所得，然后凍干備用。鄰苯三酚分析純為貴州遵義市第三化工廠產品，標準酪蛋白為British Houses Ltd.產品，DEAE-Sepharose和Sephacryl-200為Pharmacia產品，標準分子量蛋白為Pharmacia公司產品。其余產品試劑均為國產分析純。

1.2酶的分離

1.2.1酶活力的測定采用改良的鄰苯三酚自氧化法[4]。

1.2.2蛋白質濃度測定采用Lowry等方法，以酪蛋白為標準[5]。

1.2.3SOD的純化稱取6 g黃粉蟲蛹凍干粉，按重量∶體積=1∶1的比例加入0.15 mol·L^-1NaCl溶液(內含5 mmol·L^-1CuCl2)。勻漿后，在15 000 r·min^-1、4℃下離心15 min，上清液加入固體(NH₄)2SO₄至40%飽和度后離心，上清液繼續加入固體(NH₄)2SO₄至60%飽和度，離心，沉淀用少量pH7.6、2.5 mmol·L^-1的磷酸鉀緩沖液溶解。然后裝入透析袋中對重蒸水透析24 h，用聚乙二醇(PEG)濃縮至3 mL，得粗酶液。將粗酶液放入Sephacryl-200柱(先用pH值7.6，2.5 mmol·L^-1的磷酸鉀緩沖液平衡)，流速控制在0.25 mL·min^-1。收集合并SOD活力部分。SOD洗脫曲線見圖1。

2結果分析

2.1蜂王漿SOD分離純化

分離過程中，酶的總活力和比活力的變化情況見表1。酶的最終提純倍數為524.5，回收率為12.5%。本方法與其他分離方法相比，未采用容易使酶變性失活的加熱沉淀和有機溶劑分級分離工藝，條件更溫和，簡單易行，而且所獲的SOD比活較高。

2.2酶的純度鑒定

將純化得到的酶經聚丙烯酰胺凝膠電泳，再用考馬斯亮藍R-250進行蛋白染色。結果如圖2所示，只顯示1條蛋白區帶，表明該酶已達到電泳純。

2.3pH對SOD的影響

用50 mmol·L^-1的磷酸鉀配制一系列pH梯度的緩沖液(緩沖液范圍為pH值7.8～8.5)，然后在不同pH下用同上的酶活力測定方法進行酶活力測定。以最高酶活力為100計，并把其他酶活力換算成相對酶活力，作pH-酶活力曲線圖(圖3)。由圖3可知，在本試驗條件下，酶的最適pH值為8.35，pH值高于或低于8.35，酶活力均有明顯下降趨勢，pH值在8.0以下和8.5以上，酶活力為零。

2.4溫度對SOD活力的影響

在上面所測最適合的pH下，將酶在不同的溫度下(溫度范圍為0～70℃)與鄰苯三酚保溫15 min，然后再按同樣的方法進行酶活力的測定，以最高酶活力為100計，其余不同溫度下所測酶活力換算成相對酶活力，作溫度一酶活力曲線(圖4)。由圖4可知，在此條件下，酶的最適溫度為25.5℃，低于25℃時，SOD活性降低，0℃時，SOD活性還保持近50%。溫度高于25℃時，SOD活性很快降低，達50℃時，SOD活性全部喪失。

3討論

自從McCord和Fridovich首先從牛的紅細胞中提取到SOD以來，迄今為止人們已經從細菌、真菌原生動物、藻類、昆蟲、魚類、植物和哺乳動物等各種生物體內分離得到了SOD[6]，家蠶血淋巴中也存在著SOD[7]。本研究利用DEAE-Sepharose柱層析和SephacrS-200分子篩層析的方法，從黃粉蟲蛹中分離得到電泳純的SOD酶制劑，比活力為18 U·mg-1，純化倍數達524.5。該方法與其他分離SOD的方法相比，未采用加熱沉淀和有機溶劑分級分離工藝，條件更溫和，簡單易行，且所獲SOD比活較高。在一定的溫度條件下，黃粉蟲蛹中SOD的熱穩定性較好，為SOD的提取提供了新的酶源。

參考文獻：

[1]趙保和.氧自由基和天然抗氧化劑[M].北京：科學出版社， 1999.133-145

[2]KIM E J， KIM H P， HAH Y C， et al.Differential expression of superoxide dismutases containing Ni and Fe/Zn in Streptomyces coelicolor[J].Eur.J.Biochem.，1996，241：178-185.

[3]Youn H D，Kim E J，Roe J H， et al.A novel nickel- containing superoxide dismutase from Streptomyces spp [J].Biochem，1996，318：889-896.

[4]鄧碧玉，袁勤生，李文杰.改良的鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的方法[J].生物化學與生物物理進展， 1991，18(2)：163-166.

[5]Lowry O H， Rosebrough N J， Farr A L Randall R J. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. J. Biol. Chem. 1951，193：265-275.

[6]勤生，謝衛華，姚菊芳，等.修飾SOD-CTS復合酶的制備及其性質研究[J].中國醫藥工業雜志，1989，20(8)：351-355.

[7]段家龍，陸翠珍，古賀克己，等.家蠶血淋巴超氧化物歧化酶初步研究[J].蠶業科學，1995，21(2)：102-105.

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