纖維素酶在苜蓿葉蛋白提取中的應用

摘要：將纖維素酶應用于苜蓿葉蛋白的提取，研究酶解反應時間，反應溫度，底物濃度和加酶量4因素不同水平對苜蓿葉蛋白提取率的影響，并對提取工藝進行優化，試驗表明對提取率影響順序為：反應溫度>反應時間>加酶量>底物濃度，最佳工藝為，加酶量10 U·g^-1，底物濃度1∶6，40℃反應1 h。

關鍵詞：苜蓿；纖維素酶；葉蛋白

中圖分類號：TQ936.2文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0830-03

Application of Fibrin Enzyme to Separate Alfalfa Leaf Protein

ZENG Fang-zhi1，TIAN Li-ping1，XUE-Lin2，LI-Min1

(1.Colllege of Biology， Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang，China；2.Shihezi Vegetable graduate school，Shihezi 832003，Xinjiang，China)

Abstract：In this research fibrin enzyme was used to separate alfalfa leaf protein. The effects of reaction time，temperature，content chroma and the quantity of enzyme in different levels on the extraction ratio of alfalfa leaf protein was also analysised. The results showed that the influencing sequence were as follows： reaction temperature> time>enzyme’s quantity>content chroma.The optimum parameters were enzyme’s quantity 10u·g^-1，chroma content 1∶6， reaction time 1 h under 40℃.

Key words：alfalfa； fibrin enzyme； leaf protein

紫花苜蓿(Medicago Sativa Linn.)為豆科(Leguminosae)多年生草本植物[1]。苜蓿葉蛋白產量高，是葉蛋白生產中常用的原料[2，3]。植物莖葉中的蛋白質包裹于細胞壁內，需要通過切碎，壓榨等方法擠出細胞中的汁液，才能獲得蛋白質部分。苜蓿細胞壁含有大量纖維素(18%～30%)[4]，而纖維素酶是一種很好的生物催化劑，具有很強的降解纖維和崩潰植物及種子細胞壁的功能[5]。用纖維素酶催化苜蓿細胞壁中的纖維素水解，使纖維素增溶和糖化，降解植物細胞壁，以利于葉蛋白的提取和分離[6]。加熱法是應用最早、最普通的傳統方法，但耗能大，成本高，不利于經濟化生產[7]，另外常用方法還有酸法，堿法等。纖維素酶已廣泛應用于食品加工領域，但將其應用于葉蛋白提取的研究很少，因此本文對這一方法進行探索，為生產實踐提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

原料：選取石河子大學農試場孕蕾中期[8]的阿爾岡金紫花苜蓿(Medicago sativa L.)。纖維素酶：上海源聚科技有限公司，酶活力15 U·mg^-1。試驗儀器：JA2003型電子天平，HR2838型組織搗碎機，TDL-5型臺式電動離心機，PHS-10B型酸度計，DHG-9101-2S型電熱恒溫干燥箱，基爾特克2300凱氏定氮儀。主要試劑：濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀等。

1.2方法

1.2.1提取工藝除去苜蓿表面的土壤，摘除枯萎、變黃、腐爛和有病蟲害的葉片，再將原料切成長度約1 cm的小段，經纖維素酶處理后置入打漿機，加入3倍重量的水，打漿2～3 min，倒出草漿2層紗布過濾，清洗打漿機1次，將清洗液與濾渣混合過濾，收集所有濾液。用酸調節濾液pH值至4.0，沉淀，離心分離葉蛋白，烘干，測定提取率。

1)單因素對葉蛋白提取率的影響研究反應溫度，反應時間，加酶量和底物濃度的不同水平對葉蛋白提取率的影響。由于纖維素酶的最適pH值為5，本試驗中酶解溶液的pH值均調節為5。反應溫度：底物濃度1∶8，加酶量20 U·g^-1，在40℃，50℃，60℃，70℃反應1 h。反應時間：底物濃度1∶8，加酶量20 U·g^-1，在50℃分別反應1 h，1.5 h，2 h。加酶量：底物濃度1∶8，加酶量取0，10，20，30，40 U·g^-1，50℃反應1 h。底物濃度：底物濃度分別取1∶6，1∶8，1：10，

1∶12，加酶量20 U·g^-1，50℃反應1 h。

2)提取工藝的優化試驗采取4因素3水平正交設計方法，以提取率(數據為3次重復試驗的平均值)為衡量指標，具體因素水平項目設計及數據處理結果如表5。

1.2.2測定方法粗蛋白的測定：半微量凱氏定氮法；葉蛋白提取率的測定[9]：P(%)=[(W1×P₁)/(W2×P₂×P3)]×100%，式中P為提取的葉蛋白占總蛋白的百分比，W1提取的葉蛋白干粉質量，W2為每次處理的苜蓿鮮葉質量，P₁為粗蛋白占提取葉蛋白干粉質量的百分比，P₂為苜蓿鮮樣中干物質的百分含量，P3為鮮葉中粗蛋白質占干物質的百分含量。

2結果與分析

2.1單因素對葉蛋白提取率的影響

2.1.1反應溫度對葉蛋白提取率的影響隨溫度的升高提取率下降。在纖維素酶嚴重變性溫度以下，溫度對纖維素水解的作用包括兩個方面：一方面隨著溫度的升高分子更加活躍，碰撞更加頻繁，纖維素與酶分子之間的碰撞機率增大，從而提高了纖維素的水解作用，使提取率增大；另一方面隨著溫度的升高，酶的變性加速，從而使酶活性降低，水解減少[10]。在本試驗中40℃時纖維素酶的活性最大，對葉蛋白提取率的影響最明顯。

2.1.2反應時間對葉蛋白提取率的影響數據顯示酶解1h葉蛋白提取率最高，隨著反應時間的延長提取率降低，這種現象符合酶解過程的一般規律，即酶解反應初期體現為過量底物存在下的零級反應期，產物得率上升很快，隨著時間延長，酶解反應速度逐漸變小直至為零，原因有底物濃度下降產物濃度增加，產物抑制以及酶變性失活等[11]。本研究目的是最大程度提取葉蛋白，因此酶解1 h為宜。

2.1.3加酶量對葉蛋白提取率的影響纖維素的水解在加酶量為30 U·g^-1時最高，葉蛋白的提取率最大。考慮酶的價格因素和提取情況，應該在獲得滿意的提取率的前提下，盡量選擇較少的加酶量，因此，單因素作用時30 U·g^-1的加酶量較好。

2.1.4底物濃度對葉蛋白提取率的影響底物濃度對葉蛋白的提取率的影響不存在明顯規律，當底物濃度為1∶8和1∶12時較高。在起始較高固液比1∶6時，由于含水量過低，導致酶與底物不能充分結合，使得提取率較低，隨著用水量的增加，在底物濃度1∶8時提取率增大，但再增加用水量到1∶10，提取率減小，主要是因為底物含量不變，隨著含水量的增加導致酶與底物的結合幾率減少，從而影響反應速率。試驗中底物濃度為1∶12時，提取率又出現增高，不符合規律，值得進一步探討[12]。

2.2提取工藝的優化

表5結果與某些因素單獨作用時的最佳條件存在差異，綜合考慮各因素共同作用的效果，纖維素酶應用于苜蓿葉蛋白提取的最佳工藝為A1B1C1D1，各因素對提取率的影響效果為C>A>B>D，即酶解1 h，加酶量10 U·g^-1，反應溫度40℃，底物濃度1∶6，各因素最佳條件在實際操作中均是最容易實現，最方便節能的。

3討論

本試驗將纖維素酶應用于葉蛋白的提取，利用酶本身的特性，破壞束縛蛋白質的細胞壁，提高蛋白質的溶出率，再加入酸性物質調節溶液的pH值到等電點而沉淀葉蛋白，具有蛋白質提取效率高、凝集迅速和葉蛋白加工損失率低等優點。用最佳工藝得到的提取率為49.271 4%，與其他苜蓿葉蛋白提取方法相比[9]，本試驗的提取率高，操作簡單。同時隨著酶工業的發展，纖維素酶生產成本的不斷降低和酶應用技術研究的不斷入，酶解方法將成為提取葉蛋白的有效方法之一[10]。

參考文獻：

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