維羅納氣單胞菌維管束狀纖毛ｍｓｈＢ基因突變體的構建

（邵陽醫學高等專科學校，湖南 邵陽 422000）

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摘 要：目的：構建維羅納氣單胞菌維管束狀纖毛mshB基因突變體。方法：首先根據已知的近緣霍亂弧菌的mshB基因序列，設計PCR引物，擴增并克隆了mshB基因，亞克隆于自殺質粒后，通過同源重組替換野生型mshB基因。結果：經過PCR篩選證實重組質粒已插入細菌的基因組中。結論：成功構維羅納氣單胞菌維管束狀纖毛mshB基因突變體，為研究mshB基因在其致病過程中所起的作用奠定了基礎。

關鍵詞：維羅納氣單胞菌（Aeromonas veronii）；連接類纖毛（Bfp）；mshB基因 

中圖分類號：R37文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2008）10-0014-03

氣單胞菌屬曾經被分類為弧菌科家族。但現在有了自己的家族叫氣單胞菌科。到今天，只發現有七個種類與人類疾病相關，包括：A. hydrophila， A. veronii biovar sobria， A. caviae， A. veronii biovar veronii， A.jandaei， A. schubertii and A. trota (Martin-Carnahan， 2005)。Bfp，取自臨床腹瀉感染的氣單胞菌屬種。被純化后的纖毛屬于四型纖毛。目前國內外對維羅納氣單胞菌維管束狀纖毛msh基因座研究的很少，僅有少量文獻報道。這次對羅納氣單胞菌維管束狀纖毛mshB基因突變體的構建對于進一步了解mshB基因功能和機制做了基礎性工作。

1 材料和方法

1.1 細菌和質粒種類（見表1）

表1 細菌和質粒種類

1.2 擴增

引物按照之前Kirov etal (Kirov and Sanderson，1996)報道的氨基端序列設計出引物進行測序。

引物：

擴增含有mshB基因的PCR片段

用設計的引物MSHAKF1和MSHAREV，使用Pfx擴增。

-MSHAKF1

5’CAATGAAACCAATGGCACTAACAATG 3’

-MSHAREV

5’GCAGGCTCATGCATATTGAC 3’

檢測突變體是否成功的片段

用設計的引物MSHAKF1和BFPREV1，使用Pfx擴增。

-BFPREV1

5’CAGAATGATGACGATAACCAG 3’

1.3 細菌培養基和生長條件

含有抗甲氧芐啶質粒的E.coli CC118-λpir 用Isosensitest agar，37℃ 隔夜培養。其它所有細菌都在BHIB中37℃ 隔夜培養。80℃冰箱保存。

1.4 染色體DNA提取

把臨床取得的strain BC88在BHIB中，37℃過夜培養后離心（3，000RPM=1614×g，15min，室溫）。上清倒掉，把離心后附在底部的細菌用A溶液混勻，并加入溶菌酶。放入37℃培養30min，接著放入80℃冰箱冷凍10min。加入B溶液后晃動混合物，直到變為清澈。加入RNA酶，然后在37℃培養30min。加入蛋白酶K，37℃培養30min。加入與混合物等量的酚，混合均勻后離心（13，200RPM=16100×g，5min，室溫），留上清液。反復3次。在上清液中加入醋酸鈉和冰乙醇，在20℃保存30min后離心（13，200RPM=16100×g，20min，4℃）。倒掉上清，加入消過毒的純凈水，4℃過夜后放入20℃冰箱備用。

溶液A溶液B

-10 mM Tris-HCL， PH7.2-100 mM Tris-HCL， PH8.8

-150 mM NaCL-1% SDS

-100 mM EDTA-100 mM NaCL

1.5 質粒提取

取少許細菌在10mLBHIB中37℃，搖動培養過夜。然后按照QIAgen提取。

1.6 酶切和連接

普通質粒DNA酶切反應用10×緩沖溶液，在合適的溫度下，酶切1.5~2.0h，然后用QIAgen PCR column kit提純。重組質粒DNA酶切后用agarose gel electrophoresis 分離，QIAgen gel extraction kit回收。

用T4連接酶按照INVITROGEN方法連接。

1.7 轉化

把重組DNA通過Hanahan方法轉入合適的大腸桿菌。把受體細胞和重組混合物混合放在冰上1h，然后42℃熱激90s。接著把混合物再次放入冰中1min，加入800 mL BHIB，37℃ 搖動熱孵化1h。把轉化后的混合物平抹在含有合適抗生素的LBA上進行藍白選擇。

1.8 受體細胞制作

大腸桿菌培養到對數生長期后放冰上孵化15min，讓后離心（3，000RPM，15min）。棄上清，加入1/3原液體積的RF1溶液并震蕩。而后，再次同樣條件離心。棄上清，加入4/5原液體積的RF2溶液并震蕩。混合溶液放冰上15min。把混合溶液分裝入eppendorf管后，瞬間在液氮中冷凍后放入80℃冰箱。

RF1 (200mL)溶液RF2(100mL)溶液

-20 mM KCL-1 mM MOPS buffer Ph6.8

-10 mM MnCL-1 mM KCL

-6 mM potatssium acetate-7.5 mM CaCL2#8226;2H2O

-2 mM CaCL2#8226;2H20-15 mM 100% glycerol

-30 mM 100% glycerol

1.9 細胞結合

把pUC19BK用EcoRI/BamHI酶切后的得到的含有mshB 和 Kmr的片段用klenow 片段和dNTP補成鈍性末端。然后連接入被SmaI酶切的自殺質粒pKNG101。把質粒轉入E.coli cc118-λpirJ進行抗卡那霉素(Kmr)和抗鏈霉素(Rifr)雙重選擇，從而得到質粒pKNG101B。少量E.coli作為質粒供體和BC88混合物在用PBS洗2次后，一同放在100mLPBS中。把混合液點在一個50mm直徑的硝化纖維素濾片上。將它們一同放在一個血瓊脂上。保持30℃，6h后用1mL PBS洗脫混合物，并稀釋10倍。最后用卡那霉素、鏈霉素和甲氧芐啶進行三重選擇。

2 結果

圖1 mshB基因擴增的的凝膠電泳（8%）分析

M為DNA ladder。1是mshB基因擴增的產物，其正確的長度是1.3kb

圖2 質粒pUC19BK的凝膠電泳（8%）分析

5.4kb的長度表明其是2.7kb的pUC19＋1.3kb mshB基因＋和1.4kb抗卡那霉素基因片段

圖3 質粒pKNG101B的凝膠電泳（8%）分析

1和2是pKNG101B，3是pKNG101。M是supercolid DNA ladder

圖4 用引物MSHAF1和BFPREV1在野生型和突變型中同時擴增SmaI酶切位點附近基因的凝膠電泳（8%）分析

1是野生型長度0.7kb。2，3和4是突變型長度2.1kb。其多出來的1.4kb和插入Kmr的片段長度吻合

3 討論

為了研究Bfp蛋白質在Bfp生物合成和相關表現型，在這次實驗中我們構建了mshB基因突變體。在將1.3kb的mshB基因的PCR片段連接入被SmaI酶切的pUC19質粒里后，用SmaI/HindIII酶切以確認其連入方向時，發現mshB基因片段以反方向插入質粒中。反復多次，仍是如此。這個現象減緩了研究工作的進度，難以解釋。可能是基因的產物對細胞有毒害，其確切原因只能留待以后研究。最后合適的質粒還是做出來了，命名MshB-。

根據其它近緣細菌中Bfp基因座推測mshB，A，C，D基因被推測屬于一個操縱子，并共用一個處于mshB基因上游的啟動子。在之前的基因測序過程中，推測在mshB基因和mshA基因之間還有一個啟動子。在mshB基因突變體構建出來以后可以做Bfp表達的實驗也就是啟動子的極性效應來證明這個推測。如果有Bfp表達則可以證明啟動子的存在，反之亦然。Bfp是第四型纖毛，被認為很多其它格蘭陰性菌最重要的致病因子。其關鍵功能是可以把細菌粘附在上皮細胞上，也可以幫助有鞭毛的細菌通過堅固表面，也就是顫搐移動。之前的研究表明氣單胞菌纖毛與細胞疏水性有關，這也許與mshB基因也有密切關系，可以在這個方面開展研究工作。總之，維羅納氣單胞菌維管束狀纖毛mshB基因突變體的構建為研究其在Bfp中的作用起到基礎性的意義。

致謝：感謝邵陽醫學專科學校檢驗系各位老師對我們這次工作的支持。

參考文獻：

［1］ Bechet，M. ＆Blondeau，R.Aeromonas spp.psssess at least two distinct type4 pilus familiese［J］. Microb Pathogen，2003，23：241-247.

［2］ Kirov， S. M. ＆ Sanderson， K.Characterization of a type 4 bundle forming pilus from a gastroenteritis-associated strain of Aeromonas veronii biovar sobria［J］. Microb Pathogen， 21， 23-34.Martin-Carnahan， A. (2005) Aeromonas infections，1996.

［3］ Mattick， J.S.Type 4 Pili and Twitching Motility［J］. Annu. Rev. Microbiol， 2000，56：289-314.

（責任編輯：王尚勇）