神術(shù)散方不同提取物體內(nèi)抗甲型流感病毒作用的研究

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046；2.江蘇省方劑研究重點實驗室，江蘇南京210046；

3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

摘要：目的：觀察神術(shù)散方中不同提取物抗甲型流感病毒的作用。方法：以甲型流感病毒(A/PR8/34)滴鼻感染小鼠，以利巴韋林作為陽性對照藥，觀察神術(shù)散方中不同提取物對小鼠病毒致小鼠死亡率等影響。結(jié)果：神術(shù)散方不同提取物對甲型流感病毒(A/PR8/34)感染小鼠具有不同程度的延長存活的時間作用，其中，羌活去油水提液的保護(hù)率為56.3%，加減甘草醇提物神術(shù)散方超臨界提取物的保護(hù)率分別為50%和43.75%，與病毒模型組比較具有顯著性差異（P<0.05）。而其混合揮發(fā)油對甲型流感病毒感染小鼠的保護(hù)率沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：神術(shù)散不同提取物均具有一定的體內(nèi)抗流感病毒作用。

關(guān)鍵詞：神術(shù)散；提取物；抗甲型流感病毒

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2008）10-0030-03

“神術(shù)散”方源于宋《楊氏家藏方》卷三^［1］。并收載于宋代官修方書《太平惠民和劑局方》卷之二，它是由蒼術(shù)、藁本、白芷、羌活、細(xì)辛、川芎、甘草等七味中藥組成的復(fù)方，主治四時瘟疫，頭痛項強，發(fā)熱憎寒，身體疼痛及傷風(fēng)鼻塞，聲重，咳嗽頭昏^［2］，為歷代醫(yī)家治療瘟病犯衛(wèi)的經(jīng)典方。為傳承經(jīng)典醫(yī)方，研制防治流行性感冒現(xiàn)代中藥成方制劑，本實驗以甲型流感病毒滴鼻感染小鼠，觀察神術(shù)散及其組成藥味的不同提取物對甲型流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用。

1儀器與試劑

1.1儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），孵箱（上海分析儀器廠），F(xiàn)A1004電子分析天平（上海天平廠）。

1.2藥材

蒼術(shù)為菊科植物北蒼術(shù)Atractylodeschinensis(DC)Koidz.的干燥根莖，購自內(nèi)蒙通遼；白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffm)Benth.etHook.f干燥根，購自四川；藁本為傘形科植物藁本LigusticumsinensisOliv的干燥根莖，購自四川；川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort的干燥根莖，購自四川；細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr.SChmidtvar.mandshuricum(Maxim)Kitag.干燥根及根莖，購自遼寧遼中；羌活為傘形科植物羌活NotopterygiumincisumTingexH.T.Chang的干燥根莖及根，購自四川資陽；甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根及根莖，購自甘肅。以上藥材均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室王春根教授鑒定。

1.3試劑

乙醚（南京試劑廠批號050107）；雞紅細(xì)胞（新鮮公雞血，用生理鹽水洗滌后備用）；氯化鈉（太倉化工廠批號050722）；苦味酸（上海化學(xué)試劑藥品供應(yīng)站批號040221）；雞膽（9~11日齡，南京中牧股份藥械廠）。

1.4陽性對照

利巴韋林片（四川美大康藥業(yè)股份有限公司，批號051101）。

1.5實驗用病毒

甲型流感病毒A/PR8/34（H1N1），由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)實驗室病毒研究所提供。

1.6實驗動物

ICR小鼠(由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證：蘇動質(zhì)97003)，隨機分組，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂全價顆粒飼料，室溫22±2℃，濕度55%~65%。

2實驗方法

2.1供試液的制備

2.1.1揮發(fā)油溶液的制備（I組~II組）

（1）混合揮發(fā)油（1）（I）：取蒼術(shù)、白芷、川芎、藁本、羌活、細(xì)辛（過20目篩）按比例混合，共100g，按照《中國藥典》2005年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法提取7h，提取后得到揮發(fā)油，用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g的混懸液。

（2）混合揮發(fā)油（2）（II）：蒼術(shù)、白芷、川芎、藁本、羌活、細(xì)辛（過20目篩）各50g，按照《中國藥典》2005年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法分別提取7h，提得的揮發(fā)油按比例混合，再用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

2.1.2油水混合液的制備（III組~V組）

（1）油水混合液（1）（III）：將混合揮發(fā)油組II與六味藥材的水提混合液（取各藥材提取揮發(fā)油后的水煎液，離心，取上清液，按比例混合，濃縮）混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

（2）油水混合液（2）（IV）：將混合揮發(fā)油組II與六味藥材混合水提液（取混合藥材提取揮發(fā)油后的水煎液，離心，取上清液，濃縮）混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

（3）油水混合液（3）（V）：將混合揮發(fā)油組I與六味藥材混合水提液混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

2.1.3水提液的制備（VI組~XI組）

（1）白芷去油水提液（VI）：除去揮發(fā)油的白芷水煎液，過濾，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥012g混懸液。

（2）川芎去油水提液（VII）：除去揮發(fā)油的川芎水煎液，過濾，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥012g混懸液。

（3）細(xì)辛去油水提液VIII：除去揮發(fā)油的細(xì)辛水煎液，過濾，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥012g混懸液。

（4）羌活去油水提液（IX）：除去揮發(fā)油的羌活水煎液，過濾，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥012g混懸液。

（5）蒼術(shù)醇提藥渣水提液（X）：取蒼術(shù)藥材80%醇提后的殘渣，加8倍量水回流提取3次，每次2h，離心，合并上清液，濃縮。濃縮液用5‰CNC-Na配制成每1mL含藥材0.034g的混懸液。

（6）藁本醇提藥渣水提液（XI）：取藁本藥材80%醇提后的殘渣，加8倍量水回流提取3次，每次2h，離心，合并上清液，濃縮。濃縮液用5‰CNC-Na配制成每1mL含藥材0.034g的混懸液。

2.1.4醇提液的制備（XII組~XVII組）

（1）白芷藥渣醇提液（XII）：取去揮發(fā)油白芷的藥渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.12g混懸液。

（2）川芎藥渣醇提液（XIII）：取去揮發(fā)油川芎的藥渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，合并醇提液，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.12g混懸液。

（3）細(xì)辛藥渣醇提液（XIV）：取去揮發(fā)油細(xì)辛的藥渣加80%的乙醇，提取3次，每次2h，合并醇提液，濃縮成每1mL含生藥0.12g混懸液。

（4）羌活藥渣醇提液（XV）：取去揮發(fā)油羌活的藥渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，合并醇提液，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.12g混懸液。

（5）蒼術(shù)藥材醇提液（XVI）：取蒼術(shù)粉末（過20目篩）30g，用80%乙醇溶液在80℃水浴上回流提取3次，每次2h，合并濾液，濃縮。濃縮液用CNC-Na配制成每1mL含藥材0.034g的混懸液。

（6）藁本藥材醇提液（XVII）：取藁本粉末（過20目篩）30g，用80%乙醇溶液在80℃水浴上回流提取提取3次，每次2h，合并濾液，濃縮。濃縮液用CNC-Na配制成每1mL含藥材0.034g的混懸液。

2.1.5超臨界提取液的制備（XVIII組~XIX組）

（1）超臨界提取液（1）（XVIII）：將蒼術(shù)、川芎、白芷、細(xì)辛、藁本、羌活六味藥材粉末（過20目篩）按處方比例混合，共200g，以95%乙醇為夾帶劑，在萃取壓力25MPa，萃取溫度45℃，分離Ⅰ溫度為40℃，分離Ⅱ溫度為35℃條件下，萃取4h，提取物用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

（2）超臨界提取液（2）（XIX）：將上述六味藥材混合超臨界提取物，按處方比例加甘草80%醇提取物（80℃水浴上回流提取，固液比為1∶8，分3次提取，每次2h，合并濾液，濾液濃縮，即得），用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.44g混懸液。

2.2甲型流感病毒雞胚增毒實驗

取9日齡雞胚，參照雞蛋上標(biāo)記氣室，放置于無菌凈化臺內(nèi)，用75%乙醇和2%碘酊分別消毒2次，用無菌砂輪輕輕于氣室隔膜處磨一小口，約0.05cm直徑大小（針尖大小）。取甲型流感病毒（粉狀），分次加入生理鹽水0.3mL，混勻后，吸出至無菌試管內(nèi)，稀釋至2mL，吹打后，每只雞胚接種0.2mL甲型流感病毒液，置37℃恒溫箱孵養(yǎng)72h。以上9日齡雞胚培養(yǎng)72h后，放入4℃冰箱，使血管內(nèi)血液凝固，次日取出，置超凈臺內(nèi)，用75%乙醇和2%碘酊分別消毒后，用無菌鑷子除去封口處石蠟，用鑷子除去氣室及隔膜層，用無菌吸管輕輕吸去尿囊液（棄去渾濁尿囊液），以上收集為增毒一次的尿囊液，以上實驗重復(fù)3次后，用于實驗，實驗前做血凝實驗。

2.3血凝試驗

取24孔板，每孔加入生理鹽水0.5mL（除第1孔加入生理鹽水0.9mL），將尿囊液編號（以每只雞胚），取尿囊液0.1mL加入第1管內(nèi)，混合后取出0.5mL加入第2管依次稀釋至第8管，第9管不加病毒，作空白對照（生理鹽水），隨后，取新鮮公雞血，用生理鹽水洗滌3次后，配成0.5%雞紅細(xì)胞生理鹽水溶液，加入0.25mL輕輕搖勻后，置室溫放置2h后觀察記錄。血凝試驗（HA）為640以上用于體內(nèi)感染小鼠。

2.4甲型流感病毒感染小鼠半數(shù)死亡（LD50）滴定

取ICR小鼠56只，體重13~16g，雌雄各半，隨機分7組，每組8只，取增毒3次的病毒尿囊液，以10倍稀釋，每組滴一個病毒濃度，各組小鼠在乙醚淺麻醉下以血凝滴度為640病毒尿囊液50μL滴鼻感染小鼠，觀察14d內(nèi)死亡數(shù)，按Reed-Muench法計算，結(jié)果甲型流感病毒的LD50為10-1.71（表1）。

2.5對甲型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)實驗

取ICR小鼠288只，體重13~16g，雌雄各半，隨機分18組，每組16只（見表1）。空白對照組：等量生理鹽水10mL#8226;kg-1；病毒對照組：等量生理鹽水10mL#8226;kg-1；利巴韋林組：50mg#8226;kg-1；藥物組分組及劑量見表1。以上各組動物均灌胃給藥，給藥劑量10mL#8226;kg-1，1次/d×5d，于給藥次日，各組小鼠在乙醚淺麻醉下，以血凝滴度640以上的尿囊液給小鼠滴鼻感染，每鼠50mL，觀察動物感染后發(fā)病情況及死亡數(shù)目，記錄14d死亡數(shù)，并進(jìn)行組內(nèi)比較存活天數(shù)和存活率。

3結(jié)果與討論

（1）神術(shù)散提取物對甲型流感病毒（A/PR8/34）感染小鼠死亡的保護(hù)的實驗結(jié)果見表2。表2神術(shù)散提取物對甲型流感病毒（A/PR8/34）感染小鼠死亡的保護(hù)作用

（2）由表2可見，神術(shù)散方不同提取物有不同程度的減少甲型流感病毒(A/PR8/34)感染小鼠死亡數(shù)，延長甲型流感病毒感染小鼠存活天數(shù)，除I、II、V、X無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各組與病毒模型組比較均有顯著性差異（P<0.05）。提示神術(shù)散方對甲型流感病毒具有保護(hù)作用。方中單味藥以IX組羌活去油水提液作用最為顯著，保護(hù)率為56.3%。

（3）本實驗表明，神術(shù)散方中抗病毒藥效物質(zhì)呈多部位和多成分性，組成藥味具有較好的互補性，醇溶性明顯好于揮發(fā)油，方中各單味藥的醇提液均明顯減少甲型流感病毒感染小鼠死亡數(shù)，保護(hù)率介于43.75%~50%之間。提示原方不用湯劑而以散劑入藥有其科學(xué)合理性。（4）超臨界CO²萃取法為復(fù)方有效成分提取的新方法。由于其萃取溫度低，尤其適合受熱易氧化分解成分的萃取。本實驗表明加減甘草醇提物神術(shù)散方超臨界提取液具有延長甲型流感病毒感染小鼠存活天數(shù)，其保護(hù)率分別為50%和43.75%。而混合揮發(fā)油和油水混合液的保護(hù)率均大大低于超臨界提取液，提示超臨界CO²萃取法對抗病毒成分具有很好的溶解性，其揮發(fā)油成分基本沒有破壞，是神術(shù)散方精制的首選方法。

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（責(zé)任編輯：陳涌濤）