豬瘟病毒引起免疫抑制的研究

摘要：綜述了豬瘟病毒引起的機體免疫抑制因素主要包括損傷免疫器官、誘導淋巴細胞凋亡、引起囊膜糖蛋白E2變異、抑制Ｉ型干擾素產生、誘發(fā)白細胞減少和引起樹突狀細胞無應答。從而干擾抗原的遞呈和抑制免疫抗體的產生。引起機體免疫抑制。

關鍵詞：免疫抑制性；免疫應答；豬瘟病毒

中圖分類號：S852.4；S852.65⁺1

文獻標識碼：A

文章編號：0439—8114(2009)06—1519—04

豬瘟(Classieal swine fever，CSF)是由黃病毒科(Fiaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬的高度接觸性傳染病。病毒粒子大小為34-50nm，其芯髓直徑約29 nm，為二十面體球狀病毒，有囊膜，其膜厚約6nm。CSFV與同屬的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)及羊邊界病病毒(Border disease virus，BDV)在結構上有很高的相似性，在血清學上有交叉反應。目前豬病毒性免疫抑制病是規(guī)模化豬場最常見的疾病之一，嚴重影響豬群的健康。已經給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。引起豬免疫抑制的病原復雜多變，不同的豬場病因可能完全不同，從而給疾病的診斷與預防帶來了很大的困難。多年的研究表明，該病因可能包括豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒、偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型等。近幾年發(fā)現(xiàn)在豬重要的傳染性病原中，豬瘟病毒與其他致病原混合感染，呈不斷蔓延的趨勢，在免疫抑制疾病發(fā)生過程中引起的作用日益增強，現(xiàn)將豬瘟病毒引起免疫抑制的因素綜述如下。

1 豬瘟病毒引起免疫器官的病變

全身皮膚、黏膜、漿膜和實質器官具有大小不等的出血點。皮膚的出血主要見于頸部、腹部、腹股溝部和四肢的內側，出血部位組織常可繼發(fā)壞死，而成為黑褐色干涸的小痂。皮下組織及肌肉內也可見到出血。病毒由入侵處進入血流，早期主要在扁桃體隱窩黏膜上皮細胞、巨噬細胞、內皮細胞、白細胞和血小板。引起扁桃體水腫，黏膜上皮細胞變性、壞死、脫落，上皮下及隱窩周圍淋巴細胞數(shù)量減少、淋巴組織壞死。出血明顯。淋巴結水腫和網狀細胞增殖，濾泡和生發(fā)中心增大，靠近皮質竇和小梁周圍竇的透明區(qū)里的血管周圍有紅細胞滲出，紅細胞聚集或浸潤到整個淋巴組織中，網狀細胞增殖，淋巴組織萎縮。脾臟組織內淋巴濾泡中央動脈管壁發(fā)生透明變性，血管腔狹窄或閉塞，實質發(fā)生水腫、壞死和出血。腎小球腫大，毛細血管壁及其內皮細胞腫脹、變性、腎小球囊內積有紅細胞，間質內毛細血管也發(fā)生不同程度的腫脹和內皮細胞變性，腎小管上皮細胞有顆粒變性或脂肪變性。非化膿性腦炎。而在延腦、中腦、腦橋和丘腦最為明顯。如為典型病變，鏡檢時只需低倍放大即能識別。反應限于血管周圍的淋巴樣細胞形成的管套變化。神經實質的病變則是血管病變引起的繼發(fā)變化。常見的有少量的神經細胞發(fā)生變性或神經膠質細胞增生形成結節(jié)。豬瘟病毒感染后造成機體免疫器官的破壞引起免疫抑制，特別容易與其他疾病并發(fā)。因此，CSFV對豬免疫器官的損傷是免疫抑制的主要原因。

2 豬瘟病毒引起淋巴細胞凋亡

Hoffmann和Suinmerfield以及Gomez等的研究表明，豬瘟發(fā)生早期可在骨髓檢測到高效價的CSFV，并可導致骨髓造血細胞的壞死和凋亡以及骨髓淋巴細胞凋亡，這表明外周血T淋巴細胞減少與CSFV導致髓淋巴細胞凋亡和血細胞生成系統(tǒng)受到損害有關。Bruschke等報道，CSFV囊膜糖蛋白E(E^m)在豬瘟病毒感染誘導淋巴細胞減少和免疫抑制的致病機制中發(fā)揮著重要作用，E^m能夠抑制伴刀豆蛋白A(Con A)誘導的豬、牛、羊和人淋巴細胞的增殖，并對淋巴細胞有細胞毒作用，E^m與不同種屬淋巴細胞體外共孵育可強烈抑制淋巴細胞的蛋白合成，誘導細胞的凋亡。用免疫組織化學和TUNEL反應雙標記試驗檢測CSFV和細胞凋亡以及TNF2α與細胞凋亡的相關性，結果病毒感染誘導的凋亡細胞數(shù)多于病毒感染細胞，顯示CSV能夠直接或間接地誘導淋巴細胞凋亡。在TNF2α和細胞凋亡的相關性方面，標記的細胞或者TNF2α陽性，或者凋亡陽性，或者二者均陽性。CSFV對豬的淋巴組織有嗜性，并可導致豬免疫系統(tǒng)的損傷。在感染初期，CSFV就侵入豬的扁桃體及其外周淋巴結的B濾泡和上皮細胞中，并在其內復制。隨后CSFV擴展進入淋巴結的其他部分、內皮及上皮細胞。原位雜交顯示，作為病毒復制及侵入淋巴結位點的濾泡在晚期結構已遭到破壞。另外，CSFV還感染并損害淋巴組織的發(fā)生中心，阻礙B淋巴細胞的成熟，從而使在循環(huán)系統(tǒng)及淋巴組織中的B淋巴細胞缺失、胸腺萎縮、白細胞減少及骨髓也遭到了破壞，這些數(shù)據(jù)表明，CSFV感染誘導淋巴結淋巴細胞凋亡可能有兩種方式，一是病毒感染直接誘導淋巴細胞的凋亡，二是CSFV感染的巨嗜細胞釋放一種或多種細胞因子(如TNF2α)誘導未感染CSFV細胞的凋亡。也有分析認為。CSFV感染細胞分泌到胞外大量的病毒糖蛋白E^m，E^m誘導了鄰近未感染CSFV細胞的凋亡。由此可見，CSFV感染誘導外周血淋巴細胞減少可能是多種機制作用的結果，

3 豬瘟病毒引起E2蛋白變異

CSFV E2基因所編碼的糖蛋白gp55已被證明是CSFV的主要結構蛋白，能誘導機體的保護性反應，是CSFV的主要免疫保護抗原，尤其是單獨的E2蛋白可以保護豬抵抗CSFV的感染。E2蛋白在CSFV各毒株間的保守性要遠低于E^m蛋白，其抗原性呈復雜性與多樣性發(fā)展。因此，CSFV在自然進化過程和長期的疫苗選擇壓力下，可能會通過改變其抗原性來逃避宿主的免疫監(jiān)控，達到持續(xù)性感染的目的。采用競爭性結合手段、中和反應及突變株分離等技術。已證實了在E2分子上存在4個獨特的抗原結構域A、B、C和D，A區(qū)又包括3個亞抗原結構域A1、A2和A3。其中B、C區(qū)是誘導產生中和抗體的主要部位，為非保守區(qū)；A1和A2在豬瘟病毒中最為保守，A1能誘導產生中和抗體；A3和D區(qū)既不保守也不誘導產生中和抗體。有資料報道，E2基因是CSFV全基因組中變異最大的部分，約為3.2％～25.0％。

對E2基因進行測序和遺傳進化分析，對其編碼序列的分析能充分說明病毒的變異和遺傳進化有關。Lowings等對CSFV基因組5'端非編碼區(qū)(NTR)的150nt、E2基因、NS5B基因中409nt序列分別進行了系統(tǒng)發(fā)生樹分析比較，發(fā)現(xiàn)E2基因區(qū)域能最好地區(qū)分不同時期、地區(qū)的CSFV株，因而E2基因在CSFV的研究中倍受重視。Lowings等對20多個不同時期、不同地方的115株疫苗株、經典毒株、流行毒株的E2基因部分核苷酸序列的遺傳進化關系進行了比較和分析，構建了CSFV的遺傳發(fā)生樹，揭示出CSFV可分為兩大基因群(Group)，5個基因亞群(Subgroup)，其中Group 1可分為2個基因亞群，Group 2可分為3個基因亞群。涂宜強等把16株CSFV流行野毒株的E基因核苷酸序列與石門株、豬瘟兔化弱毒疫苗株進行比較表明，近期流行的毒株不僅與石門株、疫苗株距離較遠，而且流行毒株呈不同亞群方向演變。廖素環(huán)等將廣西的15個CSFV流行野毒株的E2基因核苷酸序列與疫苗株比較，在可誘導產生中和抗體的抗原B區(qū)和C區(qū)，流行野毒株與疫苗株氨基酸序列同源性為81.1％～84.2％，并且在多個與特定單抗反應的氨基酸位點發(fā)生變異。van Rijn等證實，CSFV在這些特定單抗反應的氨基酸位點的改變，將導致毒株逃脫與特定單抗的免疫反應。通過對我國CSFV流行野毒株與傳統(tǒng)的石門強毒株及我國廣泛應用的豬瘟兔化弱毒疫苗株的E2序列的比較，可以看到，目前我國的CSFV流行野毒株在E2抗原基因上均存在較大的變異現(xiàn)象。E2蛋白結構的改變尤其是在抗原表位上的改變，都可逃脫抗體對病毒的清除，這也是當前造成CSFV持續(xù)性感染的一個主要原因。

4 豬瘟病毒抑制Ｉ型干擾素的產生

IFN-I是一類具有抗病毒活性、引起免疫細胞增殖和免疫調節(jié)作用的蛋白質，包括IFN-β、IFN-ω和多個IFN-α亞型。IFN-I可與細胞膜上的特異性受體結合，引發(fā)級聯(lián)性的信號放大過程，將信號最后傳遞到細胞核內，對一系列干擾素刺激基因(ISG)的表達進行調控，誘導靶細胞產生特異性抗病毒蛋白，如雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R(PKR)、2'，5'-寡聚腺苷酸合成酶等，并引發(fā)各種生理反應。I型IFN的產生依賴于包括干擾素調節(jié)因子3(in-terferon regulatory factor 3，IRF3)、NF2KB、ATF22等轉錄因子的激活，其中，IRF3是一個重要的誘導抗病毒基因轉錄的轉錄因子，可以誘導一系列干擾索刺激因子的轉錄。Proruggli等發(fā)現(xiàn)缺失了N^pro基因的CSFV突變株(△N proCSFV)盡管生長特性、蛋白表達水平與CSFV的相似，但不能阻止poly(I:C)誘導細胞產生IFN-I和出現(xiàn)細胞凋亡；相反，在無poly(I:C)存在的條件下，AN proCSFV能誘導細胞產生IFN-I。將N蛋白單獨表達于PK-15細胞，細胞在辛德畢斯病毒感染后沒有WN-α的分泌，而且IRF3蛋白的細胞漿也減少。這些結果都證明了CSFV對細胞抗病毒體系的干擾與其Npro蛋白的存在有關。IRF3還參與了病毒誘導的細胞凋亡途徑。它的減少對于CSFV在體外細胞培養(yǎng)中的持續(xù)感染也是很關鍵的。CSFV持續(xù)性感染的細胞對poly(I:C)誘導的細胞凋亡有抗性，這是否與CS-FV抑制IRF3有關還有待研究。CSFV持續(xù)性感染的細胞與人工缺失IRF3表達的細胞系一樣都可以正常地生存和分化，與未受感染的細胞一樣有著相同的生長特性，只是不能對病毒產生干擾素應答。CSFV是采用何種機制來抑制IRF3基因的轉錄以及CSFV對宿主細胞RNA合成的影響，目前尚未清楚，但是在裂谷熱病毒感染中，病毒的靶目標是轉錄因子TFIIH，從而導致宿主細胞RNA合成的抑制。辛德畢斯病毒在感染細胞后2h就可檢測到IFN的分泌，但是。CSFV和辛德畢斯病毒共感染細胞后，CSFV可以抑制辛德畢斯病毒誘導細胞產生IFN，此時CSFV尚處于感染早期，病毒蛋白還未合成。因此，CSFV可能還有其他機制來抑制IFN的產生。目前，已發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒和登革熱病毒有多種機制來抑制IFN的產生，對于CSFV是否還有其他抑制IFN產生的機制。還有待進一步研究。

5 豬瘟病毒誘發(fā)白細胞減少和引起樹突狀細胞無應答

白細胞減少和免疫抑制是豬瘟發(fā)生早期的臨床特征。用流式細胞儀對Annexin V-FITC和PI染色液標記的感染組和對照組豬白細胞進行凋亡檢測的結果，攻毒豬(攻毒后第四天)，感染組凋亡細胞占細胞總數(shù)的平均值為7.23％，對照組凋亡細胞平均值為1.40％，凋亡細胞比例顯著高于對照組。感染組處于凋亡早期的細胞數(shù)量也明顯高于對照組，達到33.86％，比對照組高25.68％。白細胞的減少與外周血淋巴細胞減少、與CSFV導致骨髓細胞凋亡、與血細胞生成系統(tǒng)受到損害有關㈦。Bruschke等報道，CSFV囊膜糖蛋白E^m在豬瘟病毒感染誘導白細胞減少而造成免疫抑制。

CSFV機體免疫反應的啟動僅有抗原和淋巴細胞是不夠的，必須要有具有抗原遞呈功能的輔佐細胞的存在，樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)作為專職抗原遞呈細胞，具有強大的抗原遞呈能力和免疫調節(jié)能力。DC位于病原入侵的門戶——黏膜和皮膚表層，通過其受體捕獲病原后遷移至引流淋巴結，發(fā)育成熟并遞呈抗原，啟動和誘導T淋巴細胞分化產生免疫反應或直接激活B淋巴細胞及產生記憶效應。Carrasco等用CSFV Brescia株體外感染DC，發(fā)現(xiàn)CSFV不誘導DC產生IFN-α；感染后的DC無任何形態(tài)、表型或功能的改變。仍然保持著抗原遞呈能力和有能力誘導T淋巴細胞的抗病毒應答。盡管只是體外的CSFV感染DC試驗，沒有完全反映出體內DC系統(tǒng)的復雜性，但是在一定程度上反映了CSFV可能采取一種未知的機制來控制或限制作為機體免疫應答過程中的啟動者和控制者——DC的激活，允許CSFV在DC內復制并利用DC可以從黏膜表面遷移到二級淋巴組織的特點，造成對淋巴組織的損害。

6 小結與展望

CSFV產生免疫抑制，引起機體不能產生能夠起到保護作用的抗體，造成CSFV與其他病原菌混合感染豬群，從而使各種疾病復雜化，給診斷和免疫帶來困難及對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。由于CSFV的廣泛傳播給養(yǎng)豬業(yè)帶來的嚴重危害，世界各國對CSF給予了高度重視，并投入了大量的人力物力對其進行研究。現(xiàn)在盡管已經取得了較大的進展，但仍有許多問題尚待闡明。我國對CSFV復制過程、與宿主細胞間的關系、致病機制以及各種防治手段研究還不是很深入，需要加大力度預防和控制CSFV的發(fā)生。

(責任編輯 昌炎新)