不同產地人參指紋圖譜研究對比

林偉斌

人參在醫療或養生方面都有可觀的價值，而不同產地的人參由于環境、氣侯、水土等因素影響，其成分也有所不同，故市場上流通的人參存在不少非原產地以次充好，以假亂真的現象。

目前中藥指紋圖譜中應用最多的方法是高效液相色譜法，因為其對樣品揮發度和熱穩定性限制小，兼具高柱效、高選擇性、靈敏度高的優點，比較適合中藥材復雜體系的分析。所以，在參考前人的研究基礎上，利用高效液相色譜法對人參藥材進行多維譜圖條件研究，尋找不同產地人參之間的識別因子以及通過人參藥材與制劑指紋圖譜的相關性分析，能科學評價及有效控制人參質量。

儀器與試劑

儀器。美國Agilent 1200 高效液相色譜儀；德國sartorius CP224S電子分析天平；天津奧特賽恩斯AS20600BDT超聲波清洗儀；上海菲恰爾TDL-5A離心機。

試劑。乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；磷酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（分析純，廣州化學試劑廠）；乙醇（分析純，廣州化學試劑廠）；人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rg1（中國藥品生物制品檢定所）；Rc、Rd、Rh1（北京恒元啟天化工技術研究院）

樣品。本實驗共收集人參藥材26批，其中吉林12批，遼寧10批，北京、山東、加拿大、東北各1批。藥用部位均為人參主根。

實驗方法

色譜條件。色譜柱：phenomenex Kinetex C18 100?（100×4.6mm，2.6μm）；檢測波長：203nm；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；流動相：以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，洗脫程序：0～17.5min，乙腈

19%，17.5～22.5min，乙腈變化到29%，22.5～35min，乙腈保持在29%，35～50min，乙腈變化至40%；分析時間：50min；進樣量：5μL。

對照品溶液的制備。精確稱取人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rh1、Rf、Rg1對照品適量，加甲醇溶解分別制成0.2mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備。取粉末（過四號篩）2g，精密稱定，置具塞離心管中，加入70%甲醇20mL，超聲提?。üβ?00W，頻率40kHz）60分鐘，3000轉離心10分鐘，上清液轉移至50mL量瓶中，濾渣再加入70%甲醇20mL，再超聲提取60分鐘，離心，上清液轉移至50mL量瓶中，用70%甲醇分次洗滌離心管，合并濾液，定容至刻度。經0.45μ m微孔濾膜濾過，取續濾液備用。

方法學考察

指紋圖譜分析與建立。精密吸取對照品溶液和吉林供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，記錄60分鐘的色譜圖。根據多批樣品的指紋圖譜給出的相關參數，所有組分在60分鐘全部出峰。選取分離度以及峰形均較好的5～60分鐘比較供試品譜圖，其中19個峰為共有峰。根據保留時間確定5號峰為人參皂苷Re，是人參的指標成分之一，將其作為內參比峰。

精密度試驗。精密稱取吉林人參藥材，按方法操作，制備供試品溶液。在色譜條件下，連續進樣5次，記錄指紋圖譜。計算各共有峰相對于內參比峰的相對保留時間和相對峰面積比值。試驗數據見表1。結果表明，各色譜峰的相對保留時間和其相對峰面積比值的RSD均小于3.0%，表明方法精密度良好，符合指紋圖譜技術要求。

穩定性試驗。精密稱取吉林人參藥材，按方法操作，制備供試品溶液。在色譜條件下，分別在0、2、4、8、16小時進行分析，記錄色譜圖。計算各共有峰相對于內參比峰的相對保留時間和相對峰面積比值。試驗數據見表2。結果表明，各色譜峰的相對保留時間和其相對峰面積比值的RSD均小于5.0%，符合指紋圖譜技術要求。

結果

遼寧人參藥材HPLC指紋圖譜中共有指紋峰的標定與技術參數的設定。將10批產自遼寧的人參指紋圖譜中各共有色譜峰的相對保留時間、相對峰面積，及其指紋圖譜輸入國家藥典委員會指定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A）中，進行圖形匹配及其數據匹配后，建立了供試品指紋圖譜的共有模式，當中含有共有峰22個。取下對照品溶液，在色譜條件下，分別注入液相色譜儀，根據保留時間確定以上各種人參皂苷在譜圖中的位置，可確定22個共有峰中，5、6、9、12、13、14、16、17、20號峰分別為人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rh、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd。

討論

提取方法的選擇。根據人參藥材的主要成分特性，結合文獻資料，實驗對索氏除雜后超聲提取、加熱回流提取法、超聲振蕩法、加熱回流后液液萃取、超聲提取后液液萃取等多種方法進行了考察。結果顯示，超聲振蕩法操作簡便易行，便對這種方法作進一步優化。采用70%甲醇和70%乙醇為提取溶劑，不同提取時間進行對比，結果表明，70%甲醇的樣品峰面積較70%乙醇的樣品峰面積大，并且隨著提取時間增加，峰面積也隨之增加。浸泡過夜后超聲與直接超聲處理相比較，浸泡過夜稍好，但差異并不明顯。因此，本文采用70%甲醇直接超聲提取2次，每次60分鐘作為人參藥材提取方法。

流動相的選擇。實驗對乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液3種溶劑系統進行梯度洗脫，以乙腈-0.1%磷酸溶液系統所得圖譜的峰形較好、分離度大。所以選用乙腈-0.1%磷酸溶液流動相系統為本實驗的流動相系統。

色譜柱的選擇。分別采用phenomenex Kinetex C18 100A（100×4.6mm，2.6μm）、phenomenex Luna 5μ C18（2） 100A（150×4.6mm，5μm）、phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP 80 A（250×4.6mm，4μm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（150×4.6mm 5μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（150×4.6mm 5μm）進行洗脫。結果表明：phenomenex Kinetex C18 100A柱洗脫出的色譜峰基本平穩，峰數多且分離度好，所以選用phenomenex Kinetex C18 100A柱作為本實驗的色譜柱。

柱溫的選擇。分別選用25℃、30℃、35℃、40℃等4種柱溫進行試驗。結果表明：25℃時分離效果最好，所以選用25℃作為本實驗的柱溫。

不同產地人參指紋圖譜的比較。各產地的人參藥材的HPLC指紋圖譜存在較大差異，北京、山東、加拿大均不含有人參皂苷Rf，但此3個產地的人參皂苷Rb1、Re、Rc的含量則比東北、吉林、遼寧的高。這說明以上 6個產地的人參藥材由于生長的地理環境、緯度和氣候的不同而導致主要化學成分含量差別很大。

指紋圖譜相似度。本實驗建立的指紋圖譜分析方法預處理簡單，色譜條件優越，出峰數量多且大多數組分達到了基線分離，指紋圖譜相似度均在0.90～1.00之間，在分析未知樣品時，凡未知樣品與標準樣本間的相似度達到以上標準，其他項目均符合質量標準時，均可作為合格藥材入藥。

指紋圖譜HPLC條件：色譜柱：phenomenex Kinetex C18 100A（100×4.6mm，2.6μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫）；檢測波長：203nm；柱溫：25℃；流速：1.0ml/min；分析時間：50min。

結論

產地為吉林的人參指紋圖譜共標示出19個共有峰；產地為遼寧的人參指紋圖譜共標示出22個共有峰。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，測得12批吉林的人參指紋圖譜相似度結果均在0.90～1.00之間；10批遼寧的人參指紋圖譜相似度結果均在0.90～1.00之間。

該人參指紋圖譜分析方法預處理簡單，色譜條件優越，出峰數量多且大多數組分達到了基線分離，可為有效控制人參藥材的質量提供可靠的依據。

（作者單位：無限極（中國）有限公司）