建立更加穩定和有效的兔耳瘢痕模型

馮登超　楊喜明　薛宏斌　賀光照

[摘要]目的：建立更加穩定和有效的兔耳瘢痕模型。方法：選用16只新西蘭大耳白兔，分別在兔耳腹側中段作1cm×1cm的全層皮膚缺損共192個，以形態學、瘢痕增生指數及羥脯氨酸（HPr）的含量變化對創面愈合后形成的增生塊，進行動態組織病理學、細胞增殖活性及膠原纖維合成等檢測。結果：兔耳腹側中段創面可產生類似于人類的增生性瘢痕，其發生率為 91.5％，增生塊最長持續時間可達120多天。結論：采用本實驗的模型復制方法，可以得到更加穩定和有效的兔耳增生性瘢痕。

[關鍵詞]瘢痕；動物模型；羥脯氨酸

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2009）02-0191-04

Establishment of an animal model for hypertrophic scar

FENG Deng-chao,YANG Xi-ming,XUE Hong-bin,HE Guang-zhao

(1.Department of Plastic and Burning Surgery,Yan'an University Affiliated Hospital , Yan'an 716000,Shaanxi,China; 2.Department of Plastic and Burning Surgery，the First Affiliated hospital ,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Abstract:ObjectiveTo establish stable and reliable animal model of rabbit ear for hypertrophic scar.MethodsFull skin defect ( 1cm×1cm in diameter)was created on the ventral side of 32 ears in 16 New Zealand white rabbits.Wound healing under natural condition was observed continuously after the operation. The scar proliferation and index on the rabbit ears were observed by light microscope,the scar HPr content was determined by improved chloraseptine Toxidizing assay.ResultsThe animal model of hypertrophic scar induced by full thickness skin wounds on the ventral side of rabbit ears was similar to that in humans.Its incidence was 91.5 %.The hypertrophic scar could last 120 days.ConclusionFull thickness skin wounds on the ventral side of rabbit ears could produce stable and reliable hypertrophic scars.

Key words: scar；mode1 animal；HPr

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是常見的病理性瘢痕，一直都是整形外科和創傷外科研究的熱點和難點問題，但其機理到目前尚未明確[1]。對其發生機制和防治的研究一直進展甚微，最主要的原因是目前尚缺乏一種合適的動物模型。盡管曾有人采用了將人增生性瘢痕移植于裸鼠皮下的動物模型[2]，但在有免疫缺陷的動物身上實驗，很難得出符合客觀實際的結論；1997年Morris等[3]觀察到兔耳內側皮膚損傷后有真皮增生現象，并初步建立了急慢性瘢痕模型，為進一步研究提供了一種新的途徑，但仍存在復制成功率低等缺點。本實驗的目的是通過改進Morris的方法，建立一種更加穩定、有效、復制率高的動物瘢痕模型。

1材料和方法

1.1 實驗材料：選用新西蘭大白兔16只，2.3～2.5kg，兔耳健全，雌雄不拘，購自重慶醫科大學動物實驗中心（動物合格證號SCXK(渝)20020001），分籠飼養。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔耳增生性瘢痕模型的制作：將動物適應性飼養1周后，瘢痕模型的制作參照Morris等[3]和李薈元等[4]方法，并加以改良，用30g/L戊巴比妥鈉1.0ml/kg (30mg/kg)作耳緣靜脈麻醉，兔耳腹側面皮膚碘伏、乙醇消毒,嚴格無菌操作技術下，在兔耳腹側中段沿長軸避開可見血管，作1cm×1cm大小創面，創面間隔1cm以上，去掉兔耳全層皮膚并用刮勺徹底刮除軟骨膜，創緣用電烙鐵燒灼，每耳6處（見圖1），共192個創面，術后創面暴露，待其自行愈合。

1.2.2形態學觀察及標本的收集：術后第1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天觀察創面愈合情況。術后第3、7、11、14、18、28、56、84天 同樣用30g/l戊巴比妥鈉作耳緣靜脈麻醉，每次隨機處死2只兔子,切取標本, 切口在創面邊緣，垂直于兔耳皮膚表面，深及軟骨表面。將每個標本平均分成2份，1份用4%多聚甲醛固定24h，常規脫水，透明，包埋，切片，然后分別進行HE、VG染色；1份用液氮快速冷凍，后轉為低溫冰箱-80℃保存, 氯胺-T 法測定HPr含量。這樣在每個時間點,每組有24個標本，共8組。

1.2.3主要觀察和檢測的指標：①創面愈合情況、上皮化時間及瘢痕增生情況；②瘢痕增生指數的變化；③瘢痕發生率；④增生塊組織中HPr的含量變化。

1.2.4 HPr含量測定[5-6]：標本稱重后勻漿,加入2mg/ml胃蛋白酶溶液1ml,4℃冰箱過夜,16 000rpm離心,取上清液0.5ml加6mol/ml 濃鹽酸1.5ml,封入安瓿瓶中,125℃烤箱3h。冷卻后加10mg/ml氫氧化鈉1.5ml,調pH 值至5～7,蒸餾水稀釋至5ml。取樣本1ml 加入檸檬酸緩沖液0.5ml、0.05mol/l氯胺-T 1ml氧化6min,加入3.15mol/ml過氯酸終止氧化5min,加入10%對二甲氨基苯甲醛1ml,100℃水浴2min,顯色后560nm比色。標準管中加入10μg/ml的L-HPr,空白管調零。最終結果計算：每克組織中HPr含量(mg/g)= 測量管光度值÷標準管光度值×10(μg/ml)÷100÷標本重量。

1.3 統計學處理：每組樣本數據以表示,用SPSS13.0統計分析軟件t檢驗及方差分析。

2結果

2.1 形態學變化及平均愈合時間：兔耳腹側全層皮膚缺損首先以血凝塊充填，隨后代之以肉芽組織，創面有少許滲出液。肉芽組織鮮紅,易出血,生長速度較快，但軟骨表面沒有肉芽組織生長。至傷后第6天創面比較干燥(見圖1)，傷后第11～14天可見創面收縮,第l5～17天可見軟骨周邊己干燥壞死并向創面內卷曲，周圍上皮及肉芽組織在壞死軟骨下向中心生長，創面周圍皮膚隆起，第l9～22天干燥壞死軟骨脫落，創面愈合，平均愈合時間（19.4±2.3）天，愈合區明顯高于周圍正常皮膚，此硬塊不斷高出皮面，開始呈淡紅色，在傷后第28天左右增生達到高峰(見圖2)，其增生范圍不超過原創緣，厚度約為耳厚的3倍,增生性瘢痕表面無皮膚附件。傷后第56天左右增生性瘢痕開始軟化，色澤變淡，但仍高出皮面(見圖3)，逐漸進入消退期。傷后第84天增生性瘢痕，顏色接近兔耳正常膚色，略高出皮面，表面平整，觸之質軟(見圖4)。兔耳增生性瘢痕可持續3～4個月。

2.2 組織學結果：HE染色顯示在術后第28天增生性瘢痕組織真皮層明顯增厚，為周邊正常真皮層厚度的3.0～4.0倍，真皮中含大量排列致密、粗大的膠原纖維，排列混亂，呈旋渦狀或結節狀，形成膠原結節(見圖5)，其間有少量炎性細胞。第56天可見真皮中成纖維細胞數目減少，血管數量減少,管腔閉塞，膠原纖維減少(見圖6),逐漸進入消退期。

2.3 HI及瘢痕發生率測定：術后第18、28、56和84天標本同時進行顯微鏡下用測微尺測量瘢痕的相對增生厚度，設定瘢痕的高度（Scar height）為SH，正常皮膚高度（dermis height）為DH，則瘢痕增生指數(Hypertrophic Index，HI)HI=SH/DH。瘢痕組織高度≥2mm，硬度與兔耳軟骨相似時即為增生性瘢痕[7]。

表1結果顯示，術后第28天組和56天組HI分別為4.15mm、3.68mm，與術后第18、84天組進行比較,差異均有顯著性意義(P<0.05)。術后第18天瘢痕發生率只有25%，而術后第28天瘢痕發生率高達91.7%，術后第56天仍維持在較高水平,至術后第84天仍有33.3%的瘢痕HI大于2mm。

2.3 HPr測定：表2和圖7結果顯示，術后第7天創緣內組織塊的HPr含量開始增加,但增加不顯著,而術后11～18天,突出組織塊的HPr含量顯著增加，至28天達到高峰，約為正常皮膚HPr含量的3.6倍，56天以后開始逐漸下降。各組與兔耳正常皮膚組比較，差異均有顯著性意義（P<0.01）。

3討論

在創傷愈合的研究中，人與動物的傷口都可以出現瘢痕性愈合，但是增生性瘢痕在動物身上很少出現，建立有效和穩定的增生性瘢痕動物模型比較困難。現有關于病理性瘢痕的研究資料，主要來源于三種途徑：一是通過體外瘢痕組織培養的成纖維細胞進行相關研究；二是將人的病理性瘢痕組織移植到裸鼠的皮下，借助對寄生狀態下的瘢痕組織進行觀察；三是通過臨床病例的觀察及術后標本的分析研究。這些方法都有一定的缺憾：①成纖維細胞體外培養體系是體外實驗，無法很好的模擬人體內環境和條件；②將人的增生性瘢痕組織移植于裸鼠皮下，它并不是動物自身產生的瘢痕組織，被移植的人類瘢痕組織脫離了人體環境，是“寄生”于裸鼠身上，對于這種處于非生理環境下的組織，想要研究觀察瘢痕的發生、發展及轉歸的全過程是不可能的；其不能完整反映創面愈合至增生性瘢痕形成整個動態變化過程，得出的實驗結果可能會有一定的偏差[2]；③臨床觀測無法細致的研究瘢痕的發生、發展及轉歸。然而，只有在動物本身產生的瘢痕模型上，才能更確切、更直接、更深入地研究瘢痕發生、發展及其轉歸。

以往由于缺乏動物自己產生的增生性瘢痕動物模型,對創面愈合的研究和增生性瘢痕的研究不能互相聯系。最近,第四軍醫大學李薈元等[8]研究建立的兔耳增生性瘢痕模型,為這兩個方面研究的結合提供了條件。李希軍等[5，9]研究發現保留軟骨去除軟骨膜可以獲得更大的瘢痕并且延長瘢痕的增生期，因為裸露的軟骨無組織營養而導致部分軟骨壞死，肉芽生長是通過溶解作用從壞死軟骨下向中心生長，延緩了創面愈合速度，導致肉芽組織在創面周圍的堆積，最后形成較大的瘢痕。

本實驗HPr含量測定結果顯示，術后7天創緣內瘢痕組織的HPr含量開始增加,但增加不顯著,而術后第11～18天,突出瘢痕組織內的HPr含量顯著增加，至28天達到高峰,56 天出現下降趨勢。

以往有關兔耳模型瘢痕發生率和HI的報道比較多，但術后瘢痕發生率一般不超過80%[6,10]。測定HI及瘢痕發生率結果顯示，本模型在牛扶幼等[11]方法上稍有改進，術后第28天組和56天組HI分別為4.15mm、3.68mm，與術后第18、84天組進行比較,差異均有顯著性意義(P<0.05)。術后第28天瘢痕發生率高達91.7%，術后第56天仍維持在83.3%較高水平,至術后第84天仍有33.3%的HI大于2mm。結果可見，經改良后兔耳創面瘢痕具有很好的有效性和穩定性。保留軟骨，切除皮膚并刮除軟骨膜，由于加深了對創面的損傷程度，從而延緩了創面愈合的速度，因此兔耳創面能產生更加穩定和有效的增生性瘢痕。本模型可以用作動態的研究藥物防治增生性瘢痕的實驗動物模型。

[參考文獻]

[1]Burd A ,Huang L．Hypertrophic response and keloid diathesis：two very different forms of scar[J]．Plast Reconstr Surg,2005,116(7):150e-157e．

[2]劉宏亮,吳宗耀.肥厚性瘢痕移植至裸鼠后的病理學觀察[J].第三軍醫大學學報,1994,16(6):434-436.

[3]Morris DE,Wu L,Zhao L,et al.Acute and chronic animal models for excessive dermal scaring：quantitative studies[J]. Plast Reconstr Surg,1997,100(3):674-681.

[4]李薈元.創傷研究動物模型--兔耳瘢痕模型的建立與應用[M].西安:第四軍醫大學出版社,2005:42-43;74-76.

[5]李希軍,柳大烈,張陽.透明質酸及透明質酸酶對兔耳創面增生性瘢痕形成影響的對比研究[J].中華醫學美學美容雜志,2001,7(4):194-197.

[6]舒彬,郝林林,吳宗耀,等.兔耳增生性瘢痕的形態學觀察與羥脯氨酸含量變化[J].第三軍醫大學學報,2001,23(3):343-345.

[7]張選奮,郭樹忠,張琳西,等.IFN-γ抑制兔耳皮膚傷口愈合和瘢痕增生中蛋白激酶C的活性變化[J].中華整形外科雜志,2006,11(6)：442-444.

[8]李薈元,劉建波,蘭海.建立增生性瘢痕動物實驗模型[J].第四軍醫大學學報.1998,19(6): 655-657.

[9]李希軍,柳大烈,王吉慧.兔耳增生性瘢痕動物模型建立方法的探討[J].中國美容醫學,2006,15(6):499-500.

[10]周勤生,馬少林,董祥林.兔耳增生性瘢痕動物模型的建立與應用[J].新疆醫科大學報,2005,28(8):746-748.

[11]牛扶幼，牛永敢，陳言湯.兔耳增生性瘢痕模型的建立[J].中國醫學工程,2004,12(5):12-14;17.

[收稿日期]2008-10-11[修回日期]2008-12-22

編輯/張惠娟