腺病毒介導外源基因經動脈轉染大鼠腹壁淺動脈島狀皮瓣的研究

李　丹　喬　群　王曉軍　曾　昂

[摘要]目的：探討腺病毒載體介導外源基因經動脈灌注轉移修飾大鼠腹壁淺動脈島狀皮瓣（Superficial inferior epigastric artery flap，SIEA）的可行性、安全性并對其轉染條件作出評價。方法： 本研究通過血管夾暫時夾閉形成局部封閉環境，應用腺病毒介導增強型綠色熒光蛋白基因 (Ad5-CMV-EGFP) 經動脈灌注帶蒂SIEA 60min。60只SD大鼠隨機分為6組： A、B、C、D組分別為：3.0×106、3.0×107、3.0×108、3.0×109pfu/ml，E組：PBS、F組：腺病毒空載體。術后7天應用活體熒光成像系統觀察皮瓣的熒光強度，應用共聚焦顯微鏡、RT- PCR檢測皮瓣組織中EGFP的表達和分布情況，通過組織學分析對皮瓣的安全性影響。結果：術后7天B組、C組、D組活體觀察皮瓣可見體表綠色熒光信號。共聚焦顯微鏡觀察結果與活體觀察結果一致，EGFP在皮瓣內血管內、外膜均可見表達，血管周圍組織包括脂肪、毛囊可見EGFP表達，皮瓣外組織未見EGFP 表達。對照組E組、F組未見EGFP表達。RT-PCR結果顯示，EGFP僅在皮瓣內表達，其他重要臟器（心臟、肝臟、腎臟）無表達。對皮瓣組織學觀察未見明顯炎癥反應。結論：復合組織瓣轉移修復創面是一種成熟的手術方式。本研究從大體觀察、組織形態學和分子生物學三方面評價外源基因經動脈內灌注轉染大鼠帶蒂皮瓣的可行性,為進一步深入研究基因修飾復合組織瓣，使其發揮治療性修復創面作用提供理論依據

[關鍵詞]腹壁淺動脈皮瓣；外源基因；經動脈灌注；腺病毒

[中圖分類號]Q343.6[文獻標識碼]Ａ[文章編號]1008-6455（2009）02-0197-05

Adenovirus mediated exgenous gene transfect rat's SIEA flap by intra-artery perfusion

LI Dan，QIAO Qun，WANG Xiao-jun，ZENG Ang

（Plastic & Aesthetic Surgery Center, Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College, Beijing 100032,China）

Abstract:ObjectiveTo study the feasibility of superficial inferior epigastric artery (SIEA) flap transfected by intra-artery perfusion with exogenous gene mediated by adenovirus, and assess the transfect efficiency and optimal conditions.Methods： In our study ,rat's SIEA flap is transfected by intra-artery perfusion with exogenous enhanced gene-green florescent protein mediated by adenovirus (Ad5-CMV-EGFP) for 60 min . 60 Sprague Dawley rats were randomly divided into 6 groups: A (3.0×106pfu/ml), B(3.0×107pfu/ml), C (3.0×108pfu/ml), D(3.0×109pfu/ml), E(PBS), F(Adenovirus),and assess the transfect efficiency and optimal conditions. Under the optimal conditions, various components of SIEA flaps and the expressions of exogenous genes in adjacent tissue are observed to evaluate the effects of this transfect model to the whole system. At the 7th day of post operation, EGFP expression in tissue was detected by IVIS Imaging System, laser scanning confocal microscope and RT-PCR .Histological evaluation was used to assess toxicity.Results:The expression of EGFP was detected by IVIS Imaging System in group B, group C, group D at the 7th day of post operation. The result detected by fluorescence microscopy was similar to IVIS Imaging System. Ad5-CMV-EGFP.EGFP expression was comfirmed in the flap's intima, and perivascular tissue including adipose tissue, follicles. The result of RT-PCR shows that the sequence of EGFP is observed in flap, but no EGFP was observed in heart、liver or kidney. Histological evaluation of the flap revealed no evidence of inflammation in the treated group.ConclusionWound reconstruction by using microvascular flaps is a mature measure in plastic surgery. In this research, the author study the feasibility to transfect exogenous genes to rat's pedicle by intra-artery perfusion. By doing this, we can further study the genetically modified microvascular pedicle flaps ,and provide theoretic references for applying pedicle composite tissue flap to perform therapeutic and reconstructive functions.

Key words：superficial inferior epigastric artery(SIEA) flap; exogenous gene; intra-artery perfusion; adenovirus

復合組織瓣在難愈創面及體表腫瘤切除后的修復重建過程中發揮重要作用。通過對復合組織瓣進行基因修飾等手段而達到基因治療的目的,是目前整形外科的研究熱點之一。有穩定血管供應的復合組織瓣是良好靶組織，其微血管床是基因經動脈灌注轉染的理想模型。動脈內灌注目的基因高效轉染修飾局部組織，使其表達治療蛋白，在移植醫學及介入醫學領域已有報道[1]，但在整形外科領域報道較少。本實驗利用大鼠帶蒂腹壁淺動脈皮瓣（Superficial inferior epigastric artery flap，SIEA）動物模型，探討腺病毒載體介導外源基因（Ad5-CMV-EGFP）經動脈介入灌注轉染復合組織瓣的可行性、安全性并對其轉染條件做出評價。

1材料和方法

1.1腺病毒載體：Ad5-CMV-EGFP 為含巨細胞病毒啟動子(CMV) 的編碼增強型綠色熒光蛋白( EGFP) 基因的血清5 型重組腺病毒載體,由北京本原正陽基因技術有限公司提供,腺病毒滴度為9×109pfu/ml，實驗前用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋成滴度為3.0×106pfu/ml、3.0×107pfu/ml、3.0 ×108pfu/ml、3.0×109pfu/ml溶液備用。

1.2 實驗動物：健康SD大鼠48只，雄性，體重0.35～0.40kg，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于北京協和醫院實驗動物中心，飼養條件SPF級。實驗動物被隨機分為6組，每組8只，A組：3.0×106pfu/ml，B組：3.0×107pfu/ml，C組：3.0×108pfu/ml，D組：3.0×109pfu/ml，E組：PBS，F組：腺病毒空載體。

1.3 基因經動脈轉移至SIEA皮瓣動物模型制備：應用戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射大鼠麻醉成功后，腹股溝和腿部備皮，應用標記筆在腹股溝動脈搏動點處設計1.5cm×1.5cm 大小皮瓣，并設計向下肢延伸約2cm長切口線（圖1）。依次剪開皮膚及皮下組織，深達腹肌肌膜表面，即皮瓣由皮膚和肉膜組成，形成以腹壁淺動靜脈為單一血供的帶蒂SIEA皮瓣（圖2）。隨后在腹壁淺動靜脈根部分離股動靜脈，應用血管夾夾閉股動脈發出腹壁淺動脈根部周圍的分支及股動、靜脈，暫時阻斷皮瓣血運，在腹壁淺動、靜脈分支處以遠0.5cm處將微套管針插入股動脈，應用血管夾固定股動脈與套管針后，套管針接口端接微量灌注泵。皮瓣首先用5mlPBS通過動脈灌注，同時保持股靜脈近心端不被鉗夾狀態，可以使血液從皮瓣血管床中排出。將皮瓣放入無菌培養皿，以溫鹽水紗布襯墊，將Ad5-CMV-EGFP 0.5ml注入1ml注射器，接微量灌注泵，以120mmHg壓力開始進行灌注時，將股靜脈近心端應用血管夾夾閉，使皮瓣保持局部封閉狀態，以溫鹽水紗布包裹皮瓣，孵育60min后，釋放套管針插口處血管夾，應用11-0絲線間斷對合縫合股動脈殘留插口，隨后釋放腹壁淺動靜脈血管蒂周圍全部血管夾，使腹壁下動脈皮瓣恢復正常血供。原位分層縫合肉膜及皮膚組織。

1.4 標本采集及檢測指標：術后第7天，從大體觀察、組織形態學和分子生物學三方面評價外源基因在對A、B、C、D、E、F6組SD大鼠帶蒂SIEA皮瓣的表達和分布情況[2]。

1.4.1 活體檢測：將各組SD大鼠分別應用戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉成功后，腹股溝及下肢應用電動剃毛器備皮，放入活體熒光成像系統（IVIS，USA）,大體觀察SIEA皮瓣綠色熒光蛋白表達情況并拍照，應用living image 3.0圖像分析軟件得出綠色熒光蛋白熒光強度。

1.4.2 標本采集后檢測：活體檢測后實驗鼠均應用過量戊巴比妥腹腔注射處死，快速切取皮瓣組織，自中央剖開，一部分組織經液氮速凍放入-80℃冰箱保存，用于逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測，另一部分組織OCT 包埋后立即放入液氮中速凍后，應用恒冷箱冰凍切片機（Leica，CM1900）切成10μm切片，-80℃保存,用于熒光顯微鏡觀測，冰凍切片剩余組織放入4%多聚甲醛溶液固定24h，石蠟包埋后，應用石蠟切片機（Leica，RM2145）切成7μm切片，行HE染色后光鏡檢測。

1.4.2.1 共聚焦顯微鏡觀察：激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS SP2）檢測EGFP表達及分布情況，掃描分辨率為1024×1024 pixel,計算機數據采集，數字成像。應用IPP6.0圖像軟件計算灰度值。

1.4.2.2 RT-PCR檢測：Purescript RNA提取試劑盒(Gentra，USA)提取皮瓣組織中總RNA，然后用RT-PCR試劑盒(Gentra，USA)一步法檢測RNA樣品中的EGFP基因表達水平。應用軟件設計引物，正義引物5'TGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT3'，反義引物5'TGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGC3'，擴增長度555bp(上海生工公司合成)。將提取的1μg總RNA樣品和RT-PCR試劑盒中試劑混合，建立50μl 的RT-PCR反應混合體系，在PCR儀(Biometra)進行反應，取10μlPCR產物上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀(Tanon)檢測RT-PCR結果并拍照。

1.4.2.3 光鏡觀察：應用倒置顯微鏡（Leica，MPS 30）觀察HE染色切片中皮瓣組織結構及炎性細胞浸潤情況。

1.4 統計學處理：實驗所得數據采用SPSS13.0統計分析軟件進行分析，應用t檢驗檢測組間差異，并以均數±標準差( x±s)表示，P<0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1 大體觀察：術后第7天，48只SD大鼠中2只出現皮瓣自噬現象，從實驗中剔除。B組、C組、D組通過活體成像系統觀察皮瓣可見體表綠色熒光信號，其中D組綠色熒光信號最為明顯。A組、E組、F組未見體表綠色熒光信號，表明腺病毒空載體（F組）、PBS（E組）和過低滴度的3.0×106pfu/ml Ad5-CMV-EGFP（A組）均無法正常表達EGFP（表1）。

2.2 共聚焦顯微鏡觀察：術后7天，對照組E組、F組SIEA皮瓣中未見明顯自主熒光物質。B 組、C組、D組共聚焦顯微鏡下可見EGFP信號，其中D組（Ad5-CMV-EGFP 3.0×109pfu/ml）在SIEA皮瓣組織的所有類型細胞中EGFP基因均有表達，內皮細胞有最好的轉染表達量，在動脈的內膜層可見強烈的綠色熒光，外膜層可見。緊鄰血管外的細胞可見EGFP表達，表示經血管灌注的Ad5-CMV-EGFP從血管內逸出，并能夠擴散至鄰近的實質組織中，多數內皮細胞可以有效的轉染（＞90%），肉膜中肌細胞（40%），脂肪細胞（30%），角質細胞及毛囊細胞（20%）（圖3）。與Ad5-CMV-EGFP高滴度（3.0×109pfu/ml）且EGFP表達最為明顯的D組相比，A組在Ad5-CMV-EGFP 3.0×106pfu/ml滴度，未見明顯EGFP表達。

2.3 RT-PCR 檢測：轉染后7天， D組SIEA皮瓣組織樣品可見在500～700bp之間有1條清晰泳帶，約550bp，與Ad5-CMV-EGFP 質粒組的EGFP cDNA 大小相一致，說明經動脈灌注Ad5-CMV-EGFP轉染SIEA皮瓣組織后7天，EGFP 基因在mRNA 水平有表達，而在皮瓣周圍組織未發現EGFP基因表達。另外D組隨機取2只SD大鼠的肝臟、心臟和腎臟組織經RT-PCR 檢測均未見EGFP mRNA 的表達（圖4）。E組、F組SIEA皮瓣組織樣品均未見EGFP mRNA 表達。

2.4 組織病理學檢查：術后第7天，光鏡下實驗組A、B、C、D組SIEA皮瓣內血管外膜周圍可見少量淋巴細胞浸潤，但無明顯血管炎表現及水腫表現，組織結構清晰。對照組E、F組可見少量中性粒細胞浸潤，類似輕度非特異性炎癥反應。

3討論

近年來，針對復合組織瓣進行的基因治療研究十分活躍，主要分為兩種治療方式，即間接體內法(Ex vivo)和體內法(In vivo)[2]。間接體內法是從患者身上獲取細胞，在體外進行細胞培養，將目的治療基因通過載體系統轉染到培養的細胞內，經過轉基因的篩選和擴增后將獲得目的治療基因的細胞送回患者體內，這是基因治療前期最常用的方法。體內法是將外源基因裝配于特定的真核細胞表達載體中，然后利用載體系統直接導體內。目前對體內法研究日益增多，成為基因治療最有前途的方法。體內基因治療復合組織瓣的給藥途徑主要有三種：局部注射、經靜脈注射系統給藥、經動脈灌注給藥。由于經靜脈注射系統給藥后能夠到達局部的較少；局部注射相對應用較為廣泛，但局部注射造成的機械壓力損傷和基因表達不均勻等缺陷限制了它們在基因治療中取得最佳的療效[3]。1998 年Taub PJ 首次報道應用VEGFcDNA經動脈灌注腹部缺血皮瓣，提高缺血皮瓣的存活面積[4-5]，是復合組織瓣經動脈灌注基因治療的雛形。復合組織瓣經動脈灌注其微血管床后，可以作為目的基因表達載體并最終產生目的蛋白。與局部注射和全身轉染的方法相比，經動脈灌注復合組織瓣的方法局部靶向性更強并且更加有效。

大鼠SIEA皮瓣是整形外科常用的皮瓣研究對象，其組織結構中包含表皮、真皮全層皮膚以及薄層肉膜結構，可以作為復合組織瓣進行研究[6]。1984年Petry JJ和Wortham KA詳細報道了大鼠SIEA皮瓣的解剖，其直接血供為腹壁淺動靜脈，間接血供為股動靜脈[7]，血管位置恒定、有穩定的組織灌注區域，大鼠股動、靜脈內徑約0.5mm左右，易于置管灌注操作。本實驗采用大鼠帶蒂SIEA皮瓣，簡化了灌注操作流程，并提高術后皮瓣成活率。我們在實驗中采用活體成像系統直接觀察術后皮瓣EGFP表達情況，使目的蛋白的檢測更佳直觀。共聚焦顯微鏡觀察結果表明，腺病毒載體可以將外源基因EGFP轉染至SIEA皮瓣的血管內膜、外膜以及血管外實質組織（脂肪、毛囊、肉膜），并且表達基因產物。為進一步深入研究經動脈灌注轉染復合組織瓣，建立了一套簡便、可靠的動物研究模型。

應用復合組織瓣轉移修復創面是一種成熟的手術方式，以往在整形外科領域僅承擔創面修復重建的功能。本實驗經動脈灌注復合組織瓣的微血管床，使復合組織瓣產生目的蛋白，發揮兼具修復重建與治療的雙重功能。這項技術不僅可以應用于皮瓣自身的治療，還可以對腫瘤切除后創面及慢性難愈性創面的進行治療性修復[8]。未來，我們將為選擇高效、安全的載體及合適的目的基因做進一步深入研究。

[參考文獻]

[1]Dyer MR. Progress and potential for gene-based medicines[J]. Mol Ther, 2000, 1: 213-224.

[2]易成剛,郭樹忠. 基因治療在整形外科中的應用[J]. 中國美容醫學, 2003, 12(3): 328-332.

[3]Michaels J, Levine JP, Hazen A, et al. Biologic brachytherapy: Ex vivo transduction of microvascular beds for efficient, targeted gene therapy[J]. Plast Reconstr Surg, 2006,118: 54-65.

[4]Taub PJ, Marmur JD, Zhang WX . Effect of time on the viability of ischemic skin flaps treated with vascular endothelial growth factor (VEGF) cDNA[J]. J Reconstr Microsurg,1998,14:387-390.

[5]Taub PJ, Marmur JD, Zhang WX. Locally administered vascular endothelial growth factor cDNA increases survival of ischemic experimental skin flaps[J]. Plast Reconstr Surg,1998,102:2033-2039.

[6]潘華,郭樹忠,張旭東,等. 近交系大鼠腹部游離皮瓣移植模型的建立及意義[J]. 中國美容醫學, 2007, 16(12): 1672-1675

[7]Petry JJ, Wortham KA. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat[J]. Plast Reconstr Surg,1984,74: 410.

[8]Marlese P, Cynthia H, Michaels J, et al. Using genetically modified microvascular free flaps to deliver local cancer immunotherapy with minimal systemic toxicity[J]. Plast Reconstr Surg, 2008,121: 1541-1553.

[收稿日期]2008-11-20[修回日期]2009-1-10

編輯/張惠娟