ＩＦＮ－γ對大鼠創面愈合中Ｓｍａｄ７表達的影響

李　璐　王繼華　趙亞南　李允怡

[摘要]目的：將干擾素γ（IFN-γ）應用于大鼠創面，觀察創面肉芽組織的生長、成纖維細胞數目，分析IFN-γ對Smad7的影響。方法：選取成年SD大鼠127只，建立大鼠創傷模型。實驗分成A、B、C、D、E共5組，每組25只。A組為生理鹽水溶劑對照組，B組為IFN-γ 500U /ml溶劑劑量組，C組為IFN-γ 1000U/ml溶劑劑量組，D組為2000U /ml溶劑劑量組，E組為空白組，正常對照組2只，為未損傷的正常大鼠。分別于創傷第3、7、10、14、21日隨機選取各組5只大鼠采用過量麻醉處死，剪取創面肉芽組織，分別行HE常規染色，在光學顯微鏡下觀察新生肉芽組織厚度、計數成纖維細胞數。行免疫組化染色，在光學顯微鏡下觀察肉芽組織中Smad7的表達情況。結果：各時間點A、B組肉芽組織厚度較C、D組致密且厚（P＜0.001），E組肉芽組織厚度介于A、B組和C、D組之間，（P＜0.05）；200倍光鏡下，目測計數成纖維細胞，傷后第3、21天，各組別成纖維細胞數量無差異（P＞0.05），傷后第7、10、14天，A、B組成纖維細胞數量比C、D、E組明顯增多（P＜0.001）；通過圖像分析檢測Smad7平均灰度和平均光密度。Smad7在傷后第3天、第14天表達較強，在C、D組中各時相的表達強于A、B、E組（P＜0.001），但C組和D組、A組和B組組間比較無差異（P＞0.05）。結論：干擾素γ（IFN-γ）可使新生肉芽組織生長緩慢、成纖維細胞數量減少，延長創面愈合時間，并可使大鼠皮膚創面中Smad7表達增強。

[關鍵詞]大鼠；Smad7；干擾素γ（IFN-γ）；創面愈合

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）02-0201-04

Effects of interferon-γ on and Smad7 in wound healing of rats' skin

LI Lu1，WANG Ji-hua2，ZHAO Ya-nan2，LI Yun-yi3

（1. Department of Breast,the First People's Hospital of Kunming,Kunming 650011,Yunnan,Chnia; 2. Department o Plastic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650101,Yunnan,Chnia; 3.The Wu'Plastic Hospital of Kunming,Kunming 650000,Yunnan,Chnia）

Abstract:Objective To observe the effect of Smad7 in wound healing of rats' skin, and to investigate the growth of granulation tissue and fibroblast count. To analyze the mechanism of IFN-γ on signal transduction of Smad7.Methods Full thickness excisional wound on the back of rats were used as wound models. The rats were divided randomly into 5 groups as follows;①solvent control [saline solution (0.9% NaCl), group A]; ②IFN-γ500U/ml [group B]; ③IFN-γ1000U/ml[group C]; ④IFN-γ2000U/ml[group D]; ⑤blank control [group E]. And 2 rats were compared as normal control. Wound tissues were collected on the 3rd,7th,10th,14th and 21st postwounding days. All specimens were dealed with by the pathology tectology (HE) and immunohistochemistry staining technique (SP) to observe the growth of granulation tissue, fibroblast count, the expression level of Smad7.ResultsThe growth of granulation tissue and fibroblast count of groups C and D were less than groups A and B at the same day (P<0.001). But on the 3rd and 21st day after wound, there were no differences all the groups on fibroblast count (P>0.05). Image analysis showed that there were markable difference of Smad7 among the groups A,B and groups C,D (P<0.001), Group E was between them (P<0.05). The expression of Smad7 on 3rd and 14th days after wound was higher than other days (P<0.05).ConclusionIFN-γcan make growth of granulation tissue slow down and make fibroblast count reduce in wound healing of rats' skin. After administration, the expression of Smad7 is enhancing

Key words: rat; Smad7; IFN-γ; Wound healing

創面愈合是一個復雜的生物學過程，有多種組織修復細胞、細胞外基質成分以及各種調控因素的參與，這些相關因素形成網絡共同調控創面的愈合。在調控創面愈合眾多因素中，Smads通過介導轉化生長因子β（transforming growth factor-β、TGF-βs）超家族的細胞內信號傳導，而在創面愈合的網絡調控機制中起到不容忽視的作用。本研究通過對大鼠創面模型局部外用TGF-β/Smads拮抗劑IFN-γ，了解Smad7在大鼠創面愈合過程中的變化規律。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：干擾素γ（IFN-γ）購自上海克隆生物高技術有限公司、Smad7抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。S-P即用型試劑盒、DAB顯色液、PBS液（pH= 7.2～7.4）購自福州邁新生物技術開發有限公司。BH-2型OLYMPUS光學顯微鏡、LKB-B型超薄切片機、CM2000Ｃ北航醫學病理圖像分析儀等由昆明醫學院基礎學院病理教研室提供。

1.2 實驗動物及分組：選取成年SD大鼠127只，雌雄不限，體重0.18～0.2kg。隨機分成A、B、C、D、E共5組，每組25只，正常對照組2只，單籠飼養。所有手術操作均在無菌條件下進行，以30g/L戊巴比妥鈉（35mg/kg）腹腔注射麻醉，將大鼠背部兩側剪毛，常規術前準備消毒。在大鼠背部剪去四塊大小為1cmx1cm的全層皮膚，形成缺損，創面間隔2cm，125只大鼠無死亡。每日分別外用IFN-γ溶液 和0.9%生理鹽水換藥：A組用0.9％生理鹽水；B組用IFN-γ500U/ml溶液；C組用IFN-γ 1000U/ml溶液；D組用2000U/ml溶液；E組為空白組，即傷后不作任何處理。

1.3 取材和染色：分別于術后第3、7、10、14、21日隨機選取各組5只大鼠采用過量麻醉處死，剪取創面肉芽組織，范圍包括周圍正常組織，深達肌層。分別行蘇木素－伊紅常規染色（HE染色）和免疫組化染色。觀察HE染色切片，40倍光鏡下選取不重疊的三個視野，以計算機顯微測微尺測量新生肉芽組織厚度，同法在200倍光鏡下，目測計數成纖維細胞。免疫組化染色（SP染色）后，在高倍鏡（×400）下，用圖像分析儀對Smad7陽性細胞進行平均光密度、平均灰度的測量。

1.4 統計學處理：數據用均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS13.0 for windows 統計軟件包進行方差分析和兩兩比較q檢驗，處理檢驗水準α為0.05，P<0.05差異具有顯著性。

2結果

2.1 新生肉芽組織厚度：40倍光鏡下觀察，各組別新生肉芽組織于術后第3天開始形成，厚度于術后第7天增厚明顯，第10天達峰值，第14天開始下降，第21天接近正常大鼠皮膚。各時間點A、B組肉芽組織厚度較C、D組致密且厚，組間比較差異具有顯著統計學意義（P＜0.001）。E組肉芽組織厚度介于A、B組和C、D組之間，組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 成纖維細胞計數：200倍光鏡下，在創面肉芽組織中選取3個不重疊視野，目測計數成纖維細胞，術后第3、21天，各組別成纖維細胞數量無差異（P＞0.05）。傷后第7、10、14天，A、B組成纖維細胞數量比C、D、E組明顯增多（P＜0.001）。各組內成纖維細胞數均在第10天達到高峰，不同時間點成纖維細胞計數差異具有顯著性（方差分析P＜0.001）。

2.3 創面愈合中Smad7的表達：免疫組化染色后，成纖維細胞胞漿、胞核均呈陽性染色，即呈淺棕色至棕黑色細顆粒狀，新生毛細血管內皮細胞胞漿呈淺棕色。Smad7在術后第3天、第14天表達較強，在成纖維細胞胞漿和胞核內呈強陽性表達，在C、D組中各時相的表達強于A、B、E組，差異有顯著性（P＜0.001），但C組和D組、A組和B組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。Smad7在E組中各時相的表達均介于C組和D組、A組和B組之間，且差異有統計學意義（P＜0.05）。

各時相Smad7平均灰度如表4示：C、D組與A、B組之間差異有顯著性（P＜0.001）,E組分別與A、B組和C、D組之間存在差異，經統計學分析有意義（P＜0.01）。但是，A組和B組間，C組和D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。Smad7的表達于傷后第3、14天最強，第7天表達最弱。

3討論

Smad Smad是Mad和Sma蛋白及其類似物的統稱,即Smad(Sma-Mad)族蛋白，是細胞內特異轉導TGF-β調控信息的信號傳遞分子[1]。目前,已發現8種Smad分子,其中Smad2,3,4,6,7與TGF-β的信號調控最為密切。這5種Smad按其功能分為3類:①受體調節Smad，即Smad2與Smad3。配體與受體結合后,即能磷酸化Smad2,Smad3使其激活；②共用Smad,即Smad4。Smad2與Smad3激活磷酸化后必須與Smad4形成復合物,才能遷移至胞核中促進靶基因表達；③抑制性Smad,包括Smad6和Smad7。

目前對于Smad7阻斷TGF-β信號通路,開展對器官纖維化的實驗研究已引起廣大學者的極大興趣。近來有作者[2]將含有小鼠Smad7cDNA的重組腺病毒載體導入由博萊霉素所誘導的小鼠肺纖維化模型體內,發現ColⅠmRNA、羥脯氨酸含量降低及組織病變程度減輕。Terada等[3]也通過構建Smad7基因的病毒載體實施對腎纖維化動物模型作基因治療的嘗試,發現Smad7可抑制腎間質纖維化的程度。王丹茹等[4]，將外源的Smad7基因轉入細胞內,加強內源Smad7的作用,阻斷通路,有效地下調了TGF-β的細胞內信號傳導，減少其自身基因表達。Smad7的表達可以受到其它信號轉導通路的調節，比如, IFN-γ通過Jak1酪氨酸蛋白激酶和Stat1轉錄因子可以增強Smad7的表達,這就可以解釋TGF-β和IFN-γ在調節免疫細胞功能時的相互拮抗作用。因此，增加IFN-γ可通過 Jaks-Stats通道上調Smmad7，而達到抑制TGF-β的作用。

由結果可知，與新生肉芽組織厚度和成纖維細胞計數結果相一致的是：局部外用IFN-γ（1000U/ml或2000 U/ml）可使創面內成纖維細胞數量減少、新生肉芽組織厚度減少、創面愈合時間延長。因此，我們可推測IFN-γ對于創面愈合的影響可能是通過以下途徑實現的：抑制成纖維細胞的生長增殖，導致新生肉芽組織厚度減少、增生緩慢，從而影響創面愈合。

本實驗可看出，使用外源性IFN-γ后，Smad7在劑量組C組（1 000U/ml）和D組（2 000 U/ml）中的表達較A組（鹽水組）、B組和E組（空白組）增強。B組（500U/ml）與A組（對照組）比較各指標都無統計學意義，而C、D組各指標值均比A組或B組有降低或減少，表現出顯著的統計學差異，可能C組（1 000U/ml）是大鼠創面組織發生變化的有效起始濃度。當IFN-γ濃度增加到D組（2 000U/ml）時仍然對創面組織產生明顯的作用，但是和C組比較沒有明顯的差別。

實驗結果顯示，外用IFN-γ后，C組和D組Smad7表達強于A組和B組，由此可認為當外用IFN-γ在濃度為1 000U/ml和2 000U/ml時可通過Jak-Stat通路上調Smad7。IFN-γ在濃度為500 U/ml時，可能由于濃度較低未達大鼠創面用藥的起始濃度。空白組E組在創面不做任何處理的情況下，Smad7的表達仍強于A、B組（P＜0.05），這可能是于E組在創面自然愈合過程中，由于炎性反應較A組和B組強，部分炎性因子如：白細胞介素-1（ IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF）也可通過NF/RelA轉錄因子刺激Smad7的表達，從而阻斷TGF-β1的信號傳導。

由實驗結果可看出，各組內Smad7平均光密度和平均灰度的改變基本呈一致性。Smad7在傷后第3天、第14天表達較強，在成纖維細胞胞漿和胞核內呈強陽性表達，于第21天下降達正常水平。由于目前對于大鼠皮膚創面通過局部外用IFN-γ來阻斷TGF-β/Smad通路尚無報道，因此，可在今后實驗研究中進一步探討其藥理規律。有目的地調控和干預TGF-β/Smad信號轉導途徑,有助于促進創傷愈合與胚胎發育,減輕瘢痕及纖維疾病,加深對腫瘤發生、發展的理解和認識[5]。

[參考文獻]

[1]Roberts AB.TGF-beta signaling from receptors to nucleus[J]. Microbes Infect, 1999, 1:1265-1273.

[2]Nakao A, Fujii M, Matsumura R, et al. Transient gene transfer and expression of Smad7 prevents bleomycin-induced lung fibrosis in mice[J]. J Clin Invest, 1999, 104-105.

[3]Terada Y, Hanada S, Nakao A, et al .Gene transfer of Smad7 using electroporation of adenovirus prevents renal fibrosis in post-ob-structed kidney[J]. Kidney Int Suppl,2002:61,94.

[4]王丹茹,劉偉. Smad7過度表達抑制3T3細胞增殖和TGF-β1基因表達[J]. 基礎醫學與臨床,2003,23(1):35-38.

[5]楊力,李薈元. Smad蛋白家族與TGF-β信號轉導[J]. 中國美容醫學,2001,10(6):547-549.

[收稿日期]2008-09-18[修回日期]2009-1-5

編輯/張惠娟