補體C3在周圍神經(jīng)再生條件液中的存在及其神經(jīng)生物學活性的研究

孟繁君 李青峰 李玉萍 謝 峰 昝 濤 鄭 丹 寧翁瑞 楊 湄 李 華

補體C3在周圍神經(jīng)再生條件液中的存在及其神經(jīng)生物學活性的研究

孟繁君 李青峰 李玉萍 謝 峰 昝 濤 鄭 丹 寧翁瑞 楊 湄 李 華

目的鑒定分析神經(jīng)再生條件液(Nerve regeneration conditioned fluid，NRCF)中相對分子質(zhì)量為(232～440)×103區(qū)域的蛋白條帶，并探索NRCF中補體C3可能的促神經(jīng)再生作用。方法采用Shotgun蛋白質(zhì)組學策略、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜對相對分子質(zhì)量為(232～440)×103區(qū)域的蛋白條帶的組分進行定性分析。在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中分別加入不同濃度的外源性補體C3蛋白和神經(jīng)生長因子，以Neurolucida神經(jīng)元分析軟件采集各實驗組每個大腦皮層神經(jīng)元最長突起長度。結(jié)果NRCF中相對分子質(zhì)量在(232～440)×103的蛋白條帶共鑒定到54種蛋白質(zhì)，其中包括補體C3 α鏈，補體C3 α鏈和神經(jīng)突起導(dǎo)向因子Netrins結(jié)構(gòu)中都含有一個共同功能域NTR組件。培養(yǎng)液加入特定濃度補體C3 (0.5～5 μg/mL)后培養(yǎng)96 h的神經(jīng)元突起長度較正常對照組顯著增長（P＜0.05）。結(jié)論補體C3存在于NRCF中，特定濃度補體C3對神經(jīng)元突起有明顯促進生長作用，NRCF中的補體C3可能對神經(jīng)的再生有促進作用

神經(jīng)再生條件液神經(jīng)再生補體C3神經(jīng)突

周圍神經(jīng)損傷時,在神經(jīng)遠、近兩斷端間橋接一硅膠管，形成的密閉間隔稱之為神經(jīng)再生室。再生室所形成的再生微環(huán)境及其中的主要成分—神經(jīng)再生條件液(Nerve regeneration conditioned fluid，NRCF)，是神經(jīng)再生自我調(diào)控、自我完善機制充分發(fā)揮的重要條件[1]。在我們前期工作中用鳥槍(Shotgun)蛋白質(zhì)組學策略對NRCF中相對分子質(zhì)量在(232～440)×103條蛋白帶進行質(zhì)普分析并進行了生物學分類，證實了Shotgun蛋白質(zhì)組學策略對NRCF中蛋白成分分析的有效性和可行性[2]。我們在對NRCF中蛋白成分分析的基礎(chǔ)上，利用蛋白數(shù)據(jù)庫篩選有神經(jīng)生物學活性的蛋白，發(fā)現(xiàn)NRCF中含有補體C3 α鏈，提示補體C3在NRCF中的存在[5]。

補體作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在參與機體抗微生物防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，補體C3是血漿中濃度最高的補體蛋白(1.0～1.2 mg/mL)。近年來，研究表明補體C3和其激活片段C3a在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有著許多與免疫無關(guān)的作用：補體C3活性片段C3a和其受體C3aR對小腦發(fā)育過程中神經(jīng)細胞的遷移有重要影響[3]。補體C3基因缺陷的小鼠大腦神經(jīng)元無論是發(fā)育過程中還是腦缺血性損傷后的增殖能力明顯下降[4]。但補體C3是否與周圍神經(jīng)的修復(fù)有一定聯(lián)系，以及是否對神經(jīng)元突起的生長有促進作用，卻鮮有報道。我們進行補體C3對神經(jīng)元突起生長影響的研究，發(fā)現(xiàn)特定濃度的補體C3對神經(jīng)元突起有明顯的促進作用，提示補體C3可能對神經(jīng)的再生有促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

新西蘭大白兔6只，體重1.8～2.5 Kg，雌雄不限（上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物實驗室提供），SD大鼠胚胎（胎齡16 d)（孕鼠由中國科學院上海生命科學院動物中心提供）。

內(nèi)徑3 mm外徑5 mm硅膠管(上海新亞醫(yī)用橡膠廠)；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑（Bio-Rad公司）；自然膠電泳高分子量標準試劑盒(Amersham公司)；神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)液Neurobasal Medium、2.5 S-神經(jīng)生長因子（Invitrogen公司）；其余神經(jīng)元培養(yǎng)用試劑均購自Gibco公司；Complement C3（Calbiochem公司）；小型垂直平板電泳設(shè)備（Bio-Rad公司）；LCQ DECA XP plus及Sequest軟件（Thermo Finnigan公司）；C18反相柱（180 mm×150 mm×5 μm）（Thermo Hypersil-Keystone公司）；6孔細胞培養(yǎng)板（Corning公司）；聚丙乙烯塑料離心管（NUNC公司）；超凈工作臺（上海凈化設(shè)備廠）；水平離心機（Heraeus公司）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（Heraeus公司）；解剖顯微鏡（Leica公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；Scion Image分析軟件（Scion公司）。

1.2 NRCF蛋白組分分析

1.2.1 實驗動物與模型的建立

速眠新、氯氨酮肌注麻醉大白兔后，手術(shù)暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)。游離坐骨神經(jīng)約50 mm，從中間剪斷，兩斷端用7-0縫線吻合已消毒的醫(yī)用硅膠管1根(內(nèi)徑3 mm、長40 mm)。中間間隙為25 mm，形成約100 μL的兔坐骨神經(jīng)再生室模型，6只大白兔共建立12個再生室模型。

1.2.2 NRCF自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(Nativepolyacrylamide gel electrophoresis，Native—PAGE）分析

術(shù)后7 d，用50 μL微量注射器抽盡神經(jīng)再生室中NRCF，每一個神經(jīng)再生室抽得NRCF 50～100 μL，共獲取約900 μL。分別置入無菌Eppendorf管中，每管150 μL，-70℃低溫保存?zhèn)溆茫琋ative-PAGE電泳均采用上述獲取的NRCF樣品。配制非變性PAGE分離膠和非變性PAGE濃縮膠，取高速離心后樣品上清10 μL，加入2.5 μL的5倍加樣緩沖液混合后上樣，并同時加入非變性膠的高相對分子Marker 10 μL，12 mA條件下電泳30 min，然后15 mA電泳直至溴酚藍到達底部前沿，電泳全過程在冰浴中進行。考馬斯亮藍R-350考染。以上電泳實驗重復(fù)3次。

1.2.3 （232～440）×103區(qū)域的蛋白條帶的鳥槍蛋白質(zhì)組學分析

切取相對分子質(zhì)量在（232～440）×103區(qū)域的蛋白條帶約300 μg，將其溶于100 μL變性溶劑(6 mol/L鹽酸胍，50 mmol/L Tris-HC1緩沖液，pH 8.3)，加入1 mol/L二硫蘇糖醇1 μL，37℃，2.5 h；加入1 mol/L碘乙酰胺5 μL，室溫，避光，40 min。置入截留分子量為3 000的超濾管，加入100 mmol/L NaHCO3200 μL，4℃，12 000 r/min超濾1.5 h；重復(fù)上述步驟3～4次，最后超濾至膜上溶液少于20 μL。取新的套管，倒置超濾管，12000 r/min離心約5 min。將超濾好的樣品用100 mmol/L NaHCO3稀釋至100 μL，混合，離心。加入約6 μg胰蛋白酶(Promega，37℃，18～20 h）置入截留分子量為10 000的超濾管，4℃，12 000r/min超濾1 h，將膜上液體超濾除去。將超濾至套管中的溶液凍干至少于15 μL。

上樣進行LC-MS(儀器型號為LCQ DECA XP-plus)：用0.1%甲酸將樣品稀釋至51 μL，上樣3次。RP-C18反相柱(180 μm×150 mm×5 μm），流速200 μL/min，分流比1:100，溶液A(0.1甲酸)，溶液B (0.1乙氰)，梯度360 min線性2%～85%。采用1個全掃描后緊跟3個MS的模式，得到電噴霧離子化(Electrospray ionization，ESI)質(zhì)譜總離子流圖譜和二級質(zhì)譜圖譜。應(yīng)用Sequest軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對照國家生物技術(shù)信息中心(Mational center for biotechnology information，NCBI)LAGOMORPHA(兔形目)蛋白數(shù)據(jù)庫。Sequest結(jié)果：過濾參數(shù)為，當Charge+1，Xcorr≥1.9；當Charge+2，Xcorr≥2.2；當Charge+3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0。

應(yīng)用同源性搜索、結(jié)構(gòu)預(yù)測和結(jié)構(gòu)鑒定等方法篩選鑒定結(jié)果的54種蛋白質(zhì)中可能具有神經(jīng)生物活性的蛋白。根據(jù)Identified Name（包括gi、sp、gb、emb、pir、prf、dbj、pdb等）在InterPro、SMART、Pfam等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查詢分析。

1.3 補體C3對神經(jīng)元突起的影響的觀測

1.3.1 皮層神經(jīng)元分離及原代培養(yǎng)

取孕16 d的SD大鼠，乙醚麻醉后取胚胎；解剖鏡下解剖出大腦皮層，去腦膜；剪碎大腦皮層，加0.05%胰蛋白酶于37°C孵育箱消化10 min，接種培養(yǎng)基（DMEM+10%胎牛血清+5%馬血清）中止消化后，將組織吹打懸浮成單細胞，以1×104cells/cm2接種于已置入包被好玻片的6孔培養(yǎng)板，第2天更換后續(xù)培養(yǎng)基[Neurobasal Medium+2%B-27 Supplement +Glutamine（2 mmol/L）]。

1.3.2 神經(jīng)元分組處理

分組：①正常對照組，不加入其他試劑；②NGF陽性對照組，細胞培養(yǎng)第2天加入神經(jīng)生長因子NGF，終濃度為100 ng/mL；③補體C3實驗組：細胞培養(yǎng)第2天加入補體C3，終濃度為：0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL。

各組在37℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)，每日更換新鮮培養(yǎng)液并重新加入各自相應(yīng)實驗因素，培養(yǎng)至96 h。從各實驗組隨機選取生長良好、神經(jīng)突與周邊細胞無交錯的神經(jīng)元，每組各300個，分3次實驗。用Scion Image分析軟件采集各組大腦皮層神經(jīng)元的突起長度。

1.4 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計

數(shù)據(jù)以（均值±標準誤）表示。進行單因素方差分析(Oneway-ANOVA)，實驗組各種濃度結(jié)果均與對照組之間行組間兩兩比較，P＜0.05代表有統(tǒng)計學意義，P＜0.01代表有高度統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Native-PAGE電泳結(jié)果

重復(fù)3次電泳得到的NRCF蛋白質(zhì)圖譜非常相似。NRCF經(jīng)Native-PAGE電泳分離，相對分子質(zhì)量在669×103以上有1條蛋白帶，在相對分子質(zhì)量為(67～669)×103區(qū)域存在多條蛋白帶(圖1)，相對分子質(zhì)量在(232～440)×103有1條蛋白帶，相對分子質(zhì)量在(140～232)×103有1條蛋白帶，相對分子質(zhì)量在(67～140)×103有6條蛋白帶，在含量上占NRCF的大部分。

2.2 Shotgun蛋白質(zhì)組學鑒定

針對Native-PA GE膠上相對分子質(zhì)量在(232～440)×103的蛋白條帶，切膠酶解，進一步使用電噴霧離子阱質(zhì)譜（ESI-IT-MS）進行Shotgun蛋白鑒定，獲得該蛋白條帶的ESI質(zhì)譜總離子流圖譜和二級質(zhì)譜圖譜；Sequest軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比對NCBI LAGOMORPHA蛋白數(shù)據(jù)庫，共鑒定到54種蛋白，其中含有補體C3 α鏈，其質(zhì)譜ig號為116596，鑒定肽段數(shù)為81，唯一肽段數(shù)為21，這表明NRCF中含有補體C3[5]。對鑒定到的54種蛋白質(zhì)在InterPro、SMART、Pfam等數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用同源性搜索、結(jié)構(gòu)預(yù)測和結(jié)構(gòu)鑒定等方法篩選具有神經(jīng)生物活性的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本實驗質(zhì)譜結(jié)果中的C3 α鏈與已知的神經(jīng)突起生長導(dǎo)向因子（Netrins）C端具有同源性功能域NTR組件。

2.3 補體C3對神經(jīng)元突起生長的影響

神經(jīng)元培養(yǎng)第2天，見絕大多數(shù)神經(jīng)元形態(tài)飽滿，狀態(tài)良好，部分神經(jīng)元有細小突起長出。培養(yǎng)后96 h鏡下示各組神經(jīng)元突起已經(jīng)非常明顯，其中補體C3 0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL濃度組、NGF陽性對照組各組間神經(jīng)突無明顯差別，但明顯較正常對照組和其它C3濃度組神經(jīng)元生長狀態(tài)更為旺盛，突起更長（圖2）；補體C3 0.1 μg/mL、0.2 μg/mL濃度組、正常對照組間神經(jīng)突無明顯差別。

2.4 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計結(jié)果

3次實驗圖像測得正常對照組、NGF陽性對照組、補體C3 0.1 μg/ml、0.2 μg/mL、0.5 μg/ml、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL濃度組神經(jīng)突平均長度分別為420.78 μm、485.79 μm、428.95 μm、430.46 μm、480.12 μm、567.82 μm、574.60 μm、569.24 μm。統(tǒng)計學Oneway-ANOVA分析，NGF陽性對照組、補體C3 0.5 μg/mL濃度組神經(jīng)元突起與正常對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，平均長度較正常對照組分別增長14.2%和15.4%，補體C3 1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL濃度組神經(jīng)元突起長度與正常對照組間有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），平均長度較正常對照組分別增長34.9%、36.5%和35.2%，但補體C3 1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、5.0 μg/ml濃度組間差別無統(tǒng)計學意義；0.1 μg/ml、0.2 μg/ml與正常對照組神經(jīng)間差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3)。

圖1 神經(jīng)再生條件液的自然膠電泳圖譜

圖3 培養(yǎng)96 h各組神經(jīng)元神經(jīng)突長度比較

3 討論

周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)與再生是一個復(fù)雜的生理過程，雖然顯微縫合技術(shù)可以較好地恢復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性，但神經(jīng)功能的恢復(fù)仍不令人滿意[6-7]。隨著近年來分子生物學研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)再生具有自我調(diào)控和自我完善的能力，而再生微環(huán)境則是這一能力發(fā)揮與否的關(guān)鍵[8]。由Lundborg等[9]最早提出的神經(jīng)再生室模型，為研究周圍神經(jīng)損傷后的再生機制提供了一個相對隔離的微環(huán)境，是公認的研究周圍神經(jīng)再生微環(huán)境的良好工具，然而目前對神經(jīng)再生室內(nèi)微環(huán)境的作用機制尚不清楚。NRCF體現(xiàn)了早期周圍神經(jīng)再生微環(huán)境的特征，使對NRCF的研究成為神經(jīng)再生機制的一個重要途徑[10]。本實驗對NRCF中微量蛋白成分的分析有助于了解NRCF的性質(zhì)和作用，為進一步尋找NRCF中能促進神經(jīng)再生的蛋白，從而為改進目前的神經(jīng)修復(fù)治療方法奠定基礎(chǔ)。

圖2 培養(yǎng)96 h后，各組神經(jīng)元生長情況（100×）

由于NRCF中的蛋白成分極其微量，對其分離和檢測十分困難。目前對于NRCF的分析,大多停留在對其中某種或幾種成分的分析，尚罕見對再生微環(huán)境進行總體的、系統(tǒng)的分析和報道。李青峰等[11]采用Native PAGE分離NRCF中蛋白成分，將含有不同蛋白條帶的電泳凝膠塊分別與背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)進行活性鑒定，發(fā)現(xiàn)在含有相對分子質(zhì)量為（232～440）×103間的蛋白具有明顯的神經(jīng)營養(yǎng)和趨化活性，能促使后根神經(jīng)節(jié)突起向其生長。因此，我們的實驗對該目標蛋白作進一步研究分析。

LC-MS／MS聯(lián)用，即鳥槍蛋白質(zhì)組學策略分析鑒定蛋白質(zhì)混合物，是近年來發(fā)展迅速的非凝膠新方法[12]，是將蛋白質(zhì)酶解片段混合物先后通過不同的色譜柱(如離子交換柱和反相柱)分離，分離的肽片段直接進入質(zhì)譜儀進行一級質(zhì)譜和二級串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到肽段質(zhì)量和部分碎片離子及序列的信息，最后通過計算機處理和聯(lián)網(wǎng)查詢對蛋白質(zhì)進行鑒定[13]。前期工作中我們已經(jīng)應(yīng)用鳥槍蛋白質(zhì)組學策略對NRCF中相對分子質(zhì)量為（232～440）×103間的目標蛋白條帶進行了成分鑒定和生物學分類[2]，現(xiàn)在我們在原來鑒定出的蛋白成分基礎(chǔ)上，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用同源性搜索、結(jié)構(gòu)預(yù)測和結(jié)構(gòu)鑒定等方法篩選具有神經(jīng)生物活性的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實驗鑒定出的54種蛋白成分中包含有補體C3 α鏈。補體C3激活前由α鏈和β鏈經(jīng)二硫鍵相連組成，補體C3α鏈是補體C3特有的蛋白條鏈，補體C3 α鏈的存在表明NRCF中含有補體C3[5]。由于神經(jīng)再生室是神經(jīng)兩斷端間的密閉腔隙，故NRCF中補體C3應(yīng)來源于神經(jīng)斷端的分泌而非神經(jīng)外的免疫系統(tǒng)。

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用功能域篩選發(fā)現(xiàn)補體C3樣因子的C末端和神經(jīng)突起生長導(dǎo)向因子家族Netrins的C末端存在同源性的功能域NTR組件。Netrins在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中具有促進和導(dǎo)向神經(jīng)突起的作用，而其功能域NTR組件在該過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。NTR在補體C3中的存在提示補體C3可能具有和Netrins相似的神經(jīng)生物學活性。大量研究表明，補體C3在神經(jīng)元生長和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有著積極作用。Heese等[15]發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)時，加入C3a能促使其表達神經(jīng)生長因子，具有促進神經(jīng)元生長的作用；Van Beek等[16]發(fā)現(xiàn)，C3a可以在有星形膠質(zhì)細胞存在時，保護神經(jīng)元免遭NMDA-興奮性毒素的損害。Wyss-Coray等[17]也證實補體C3可以減輕神經(jīng)損傷后的病理改變，提示補體C3可能也具有神經(jīng)保護性；Rahpeymai等[4]發(fā)現(xiàn)補體C3或補體C3aR基因缺陷的小鼠的大腦室下區(qū)、海馬齒狀回顆粒層和嗅球區(qū)的神經(jīng)增殖數(shù)目較正常小鼠有明顯下降，腦缺血性梗塞小鼠模型梗塞周邊區(qū)也觀察到類似現(xiàn)象。但目前補體C3對神經(jīng)元突起（軸突和樹突）的生長速度有無直接影響尚不清楚。我們在培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元中加入補體C3，發(fā)現(xiàn)特定濃度（0.5～5 μg/mL）的補體C3對體外培養(yǎng)神經(jīng)元突起的生長具有明顯的促進作用，提示NRCF中的補體C3可能對神經(jīng)損傷后的再生具有重要意義，但此結(jié)論尚需在體內(nèi)實驗中獲得證實，有待于進一步的深入研究。

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Investigation on the Detection of Complement C3 and Its Neurobiological Character in Nerve Regeneration Conditioned Fluid

MENG Fanjun,LI Qingfeng,LI Yuping,XIE Feng,ZAN Tao,ZHENG Danning,WENG Rui,YANG Mei,LI Hua.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng.

ObjectiveTo explore the effects of promoting nerve regeneration of complement C3 in nerve regeneration conditioned fluid(NRCF).MethodsThe protein band of the relative molecular mass of(232-440)×103in NRCF were analyzed by the Shotgun technique,liquid chromatography and mass spectrometry(LC-MS/MS).The primary cultured cortical neurons were exposed to different concentrations of exogenous complement C3 and nerve growth factor(NGF).Photograph of neurons in each group was taken every day,and the length of the longest neurite of each neuron was calculated by a neuron morphology analysis software.The neurons without exposure to the other agents and the culture fluid were served as controls.Results54 proteins were identified in the protein band of the relative molecular mass of(232-440)×103.Complement C3 alphachain protein,which had a NTR module as well as netrins in structure,was included in these proteins.The neurites of neurons with the presence of low C3 concentrations were significant longer than the neurites of normal control group after cuturing 96 hours.ConclusionThere was complement C3 protein in NRCF.Low concentration of complement C3 has positive effect on neurites growth in cultured rat cortical neurons.It implied that the complement C3 has a positive effect of promoting nerve regeneration in NRCF.

Nerve regeneration conditioned fluid(NRCF);Nerve regeneration;Complement C3;Neurite

R622+.3

A

1673－0364（2009）－01－0016－05

2008年11月22日；

2009年1月29日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.005

國家自然科學基金（30471795）。

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李青峰。