白花丹參對肺動脈高壓大鼠肺組織VEGF表達的影響

[摘要] 目的 觀察白花丹參對野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導的大鼠肺動脈高壓(PAH)模型血流動力學及肺組織血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法 SD(sprsgue-dauley SD)大鼠一次性皮下注射MCT 60 mg/kg體重，建立PAH動物模型，隨機分為正常對照組、模型組和白花丹參水提物給藥組。觀察白花丹參水提物對PAH大鼠血流動力學、肺血管重構及肺組織VEGF表達的影響。結果 與模型組相比，給藥組大鼠平均肺動脈壓(mPAP)、右心室收縮壓(RVSP)、右心指數及肺組織VEGF表達均顯著降低(P<0.05)，肺血管重構及右心功能也有所改善。結論 白花丹參水提物能有效控制MCT誘導的大鼠PAH發展進程，其機制可能與降低肺組織VEGF蛋白表達有關。

[關鍵詞] 白花丹參; 大鼠; 肺動脈高壓; 血管內皮生長因子

[中圖分類號] R285.5;R331.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)33-06-03

Effect of White Flowers Salvia on Lung Vascular Endothelial Growth Factor Expression of Pulmonary Arterial Hypertension Rats

WANG Yun YANG Nana CAO Shaohua ZHAO Xiaomin XIA Zuoli

Taishan Medical College，Institute of Life Science，Taian 271000，China

[Abstract] ObjectiveTo observe the effects of White Flowers Salvia on hemodynamic changes and lung vascular endothelial growth factor(VEGF)expression of pulmonary arterial hypertension(PAH)in rats induced by monocrotaline(MCT). MethodsPAH was induced in rats by a single subcutaneous injection of MCT at a dose of 60 mg/kg. Then the rats were randomly divided into normal control，model and drug groups. Hemodynamic changes and pathological changes of the lung and VEGF expression were detected. ResultsCompared with the model group，the mPAP，RVSP，right ventricular index and VEGF expression of rats in the drug group were significantly decreased，and the lung artery remodeling and the right ventricular functions were also improved. ConclusionThe aqueous extract of White Flowers Salvia can effectively control the process of PAH，which may be related to its role in decreasing the lung VEGF expression.

[Key words]White Flowers Salvia; Rat; Pulmonary arterial hypertension; Vascular endothelial growth factor

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一類嚴重威脅人類健康的疾病，由多種原因引起、以肺動脈血管結構重建和右心室肥大為特征。傳統中藥丹參(salvia m ilt io rrh iza bunge，SMB )屬唇形科(lab iatae)鼠尾草屬植物。藥理實驗表明，其具有保護心肌、改善微循環、抑制血小板聚集和血栓形成等多種作用，有明顯阻抑低氧誘導的肺動脈高壓大鼠肺血管結構重建的功效[1]，但對野百合堿(MCT)所誘導的肺動脈高壓模型的影響研究較少。泰山白花丹參(salvia m iltiorrhiza Bge.f.alba C.Y.WU.et H.W.Li)是丹參的變種，為山東特有珍稀瀕危藥用植物。本實驗以 MCT誘導的肺動脈高壓大鼠為模型，觀察泰山白花丹參對其影響并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

野百合堿(日本Wako公司)，肝素(天津市生物化學制藥廠，批號20041107)，右心導管(聚乙烯心導管，內徑0.6 mm，外徑0.9 mm)，MP150多導生理信號記錄儀(美國BIOPAC公司)，鼠抗鼠血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 動物分組及給藥

SPF級SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，雄性，體重180～220g，由山東中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(魯)20050015。適應性飼養3d后，隨機分為正常對照組、模型組和給藥組，每組10只，分籠飼養。自由攝食攝水，晝夜時間1:1。模型組和給藥組一次性頸背部皮下注射2% MCT 60 mg/kg體重造模，正常對照組代以注射等量的生理鹽水。白花丹參根洗凈涼干，用蒸餾水浸泡2 h，煮沸30 min，過濾，藥渣加3～5倍量水，繼續煎煮，煮沸20min，過濾，合并濾液，經濃縮，最后用水調整至所需濃度[2]。造模后第2天起，給藥組給予白花丹參14g/kg體重灌胃，每天1次，模型組代以等量的生理鹽水。

1.3 一般狀況

各組動物分別于入實驗室分組前、造模前每周測量體重，每天觀察動物的一般狀況、毛發、活動、進食等情況。

1.4 血流動力學檢測

動物飼養到期后(第22天)，稱重，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定、消毒。頸正中偏右切口，分離出右頸外靜脈，應用多導生理信號記錄系統，按孫波[3]法測量右心室收縮壓(RVSP)和平均肺動脈壓(mPAP)，并計錄右心室(RV)收縮和舒張指數(dp/dt)。同時，從左側股動脈插管，同步記錄體循環壓力(MAP)。

1.5 右心指數測定及病理觀察

記錄完畢，心臟取血備用。取血后立即處死大鼠，剖開胸腔，分離心、肺，浸入冷生理鹽水中漂洗后，分離左、右心室，用濾紙吸去血液、鹽水，分別稱取右心室(RV)和左心室加室間隔(LV + S)的重量，計算右心肥大指數RV/(S+LV)。將肺部分放入4%的多聚甲醛中固定，在左肺中部切下小塊組織，行石蠟包埋，切片予以蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肺組織的病理改變情況。

1.6 Western blot法檢測肺組織VEGF表達

組織總蛋白的提取及測量:取部分肺組織，充分剪碎，低溫液氮研磨后，加到含蛋白酶抑制劑的裂解液中，4℃裂解40min，使其充分裂解，4℃ 12000r/min，離心30min，棄除沉淀，BCA蛋白定量測定法檢測上清液蛋白含量。樣品分裝、貯存于-80℃中待用。Western blot:每份樣本上樣50μg，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳:100V電泳 1h。100mA濕法轉印40min。室溫封閉1h后，一抗1∶500(鼠抗鼠VEGF單克隆抗體)4℃孵育過夜，TTBS洗膜;二抗1∶2000室溫孵育2h，TTBS洗膜，BCIP/NBT顯色10min。凝膠成像采圖，Quantity One軟件進行灰度值分析。

1.7 統計學處理

所有的數據結果均采用均數±標準差(χ±s)表示，用SPSS12.0統計軟件進行統計學分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 動物的一般狀況

實驗前、造模前各組動物體重及一般情況無差別，毛發順且有光澤。實驗過程中，正常組體重明顯增加，一般情況良好。模型組大鼠體重上升緩慢、進食減少、毛發枯糙無光澤、一般狀況較差。給藥組情況介于兩者之間。

2.2 血流動力學檢測結果

見表1。

2.3 光鏡下病理觀察結果

正常對照組:肺泡結構清晰，泡壁毛細血管無擴張充血，肺泡上皮完整，腔內無滲出物，間質少量炎癥細胞浸潤，肺小動脈血管壁無增厚，血管腔無狹窄;模型組;肺泡壁明顯增厚，其上毛細血管擴張充血，肺泡腔內可見少量水腫液，肺組織有較多的炎癥細胞浸潤，肺小動脈血管壁明顯增厚，中膜平滑肌層數增多，管腔明顯狹窄、閉塞;給藥組:肺泡壁有少量充血或炎性細胞浸潤，肺泡無明顯擴大，肺小動脈血管壁中度增厚，管腔縮小不明顯。

2.4 右心指數及VEGF測定結果

見表2。

3 討論

PAH是晚期肺疾病的常見并發癥，預后差。無論是缺氧還是MCT 性PAH 的發展過程，均存在肺血管床的結構改變。MCT通過損傷肺動脈血管內皮，使膠原纖維暴露，肺動脈血管內血栓形成，誘導肺動脈血管壁的重建，導致pH、右心肥厚[4]，是經典的復制PH 模型的方法之一。丹參作為傳統的活血化瘀藥，有抗動脈粥樣硬化、鈣拮抗、抗炎、抗腫瘤、抗氧化損傷以及中樞抑制等多種藥理作用，廣泛應用于心腦血管疾病的防治。近幾年來，丹參藥理研究又有一些新進展。一系列研究顯示，丹參對各種因素引起的內皮細胞損傷有保護作用[5]。本實驗結果表明，模型組與正常對照組相比，mPAP，RVSP和右心指數均明顯升高(P<0.05)，光鏡下見小動脈血管壁明顯增厚，血管腔狹窄、閉塞，伴炎癥細胞浸潤等病理改變，給藥組大鼠的mPAP，RVSP和右心指數均比模型組顯著降低，差異有統計學意義，且病理觀察結果也有所改善。dp/dt max是評價心肌收縮性能的常用指標，在一定程度上受心率及前后負荷的影響并與其呈正相關;dp/dt min是心肌舒張參數，作為評價心室舒張功能的指標之一有重要意義。本實驗結果表明，模型組大鼠右心室的dp/dt max和dP/dt min均比正常對照組有明顯升高(P<0.05)，與Tiago HC等[6]報道一致，提示心肌收縮與舒張功能均有所增強，這可能是對肺動脈壓力升高的一種代償反應，而給藥組大鼠的dp/dt max和dP/dt min比模型組有所降低，提示丹參能有效控制肺血管重構和右心室肥厚，并能改善右心功能。血管內皮在調節肺血管增生方面起著重要的作用，血管內皮細胞和平滑肌細胞合成和分泌的血管內皮生長因子(VEGF)具有明顯的促內皮細胞有絲分裂和血管形成的作用，體外實驗已證實低氧可引起肺組織中VEGF及其受體的表達增多[7]。Chohreh Partovian 等[8]研究發現，VEGFmRNA表達在MCT誘導的肺動脈高壓大鼠(30d后)肺組織內下降90%，而在低氧性肺動脈高壓大鼠的肺組織內基本無變化。在我們的實驗中，模型組大鼠肺組織VEGF蛋白表達比正常對照組顯著升高，這可能是基因表達與蛋白表達存在一定的時間差距所致。丹參給藥組大鼠的肺組織VEGF蛋白表達比模型組顯著降低，這一結果提示VEGF可能參與了MCT誘導的肺動脈高壓形成過程中肺血管的重構過程，而丹參有效控制肺血管重構的作用可能與通過保護內皮細胞而降低肺組織VEGF蛋白表達有關，其具體機制還有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1] 席思川，車東緩，張婉蓉. 丹參對低氧性腺泡內肺動脈構型重建的阻抑效應[J]. 同濟醫科大學學報，1994，23(2):81-83.

[2] 李儀奎，王欽茂. 中藥藥理實驗方法學[M]. 上海:科學技術出版社，1991:36.

[3] 孫波，劉文利. 右心導管測定大鼠肺動脈高壓的實驗方法[J]. 中國醫學科學院學報，1984，6(6):465.

[4] Thomas HC，Lame MW，Dunston SK，et al. Monocro taline pyrro le induces apop to sis in pulmonary artery endo thelial cells[J]. Toxico lApp l Pharmacol，1998，5:236-244.

[5] 裴少偉，崔俊彪，羅莉，等. 丹參對慢性肺心病肺血管內皮細胞損傷的保護作用[J]. 中華結核和呼吸雜志，2003，26(10):63-91.

[6] Tiago HC，Jorge CP，Roberto RA，et al. Endogenous productin of ghrelin and beneficial effects of its exogenous administration in monocrotaline- induced pulmonary hypertention[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004， 287(6):2885-2890.

[7] Tuder RM，Flook BE，Voelkel NF. Increased gene expression for VEGF and the VEGF receptors KERFIk and FIt in lungs exposed to acute or to chronic hypoxia[J]. Clin Invest，1995，95(4):1798.

[8] Chohreh Partovian，Serge Adnot，Saadia Eddahibi，et al. Heart and lung VEGF mRNA expression in rats with monocrotaline-or hypoxia-induced pulmonary hypertension[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，1998，275:1948-1956.

(收稿日期:2009-06-16)