凍水產品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗研究

摘要對從湛江地區進出口水產品加工廠抽取的1158份凍水產品進行的單核細胞增生李斯特氏菌分析，本實驗采用了全自動酶聯熒光免疫分析儀篩選法進行了初步篩選，對分離菌株用API Listeria 試劑盒進行鑒定。經檢驗，1158個樣品中有7個樣品(0.60%)為單核細胞增生李斯特氏菌陽性，另有4個(0.35%)為 L.innocua， L.welschimeri 和L.grayi 陽性。本試驗Vidas LMO檢測試劑條呈現4個假陽性，經鑒定為李斯特氏菌屬中L.innocua，L.welschimeri 和L.grayi，表明Vidas LMO檢測試劑條存在一定的假陽性率。

關鍵詞凍水產品 檢驗 污染

中圖分類號:R155文獻標識碼:A

1 前言

單核細胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes，L.M)是一種胞內寄生菌，可引起人及多種動物致病。對人類而言 ，各年齡組均可感染而發病，但主要是免疫功能低下者最易受該菌感染，導致腦膜炎、敗血癥等疾病以及流產、早產、死胎等后果。食品，特別是海產品易被該菌污染，病人及無癥狀攜帶者也可成為傳染源。據國外有關研究報道，由單核細胞增生李斯特菌引起的食物中毒案例已超過沙門氏菌，被 WHO列為二十世紀 90年代的四大食源性致病菌之一。單核細胞增生李斯特菌引起的食物中毒發病高峰在夏季和冬季，發病率在各地區之間存在差異，根據目前的報道，歐美等發達國家發病率較高，而亞、非、拉等發展中國家報道較少，這可能與這些國家的飲食習慣差異有關。付萍等于 1996～1997年組織了全國12個省份對國內七類食品3746份樣品進行單核細胞增生李斯特菌的污染情況調查，結果表明:七類樣品中除了蔬菜外均檢出單核細胞增生李斯特菌，其分離率為:冷飲1.39%、生肉1.53%、乳制品0.52%、熟肉制品0.47%、乳0.72%及水產品0.19%。

2 材料與方法

2.1 儀器和試劑

法國生物梅里埃 (Biomerieux)公司 mini-ViDAS全自動熒光酶免疫分析儀;日本尼康(NIKON)生物顯微鏡;上海一恒科技有限公司隔水式恒溫培養箱。Demi-Fraser肉湯，Fraser肉湯，PALCAM選擇性培養基，科瑪嘉李斯特菌顯色培養基購自BD公司;VIDAS LMO試劑盒，API Listeria試劑盒購自廣州千江公司。

2.2 樣品來源

采自湛江市各進出口水產品加工廠，共1158份樣品，包括凍羅非魚片、凍熟帶頭蝦、凍熟蝦仁、凍熟鳳尾蝦、凍生帶頭蝦和凍去頭蝦6個品種。

2.3 增菌培養

以無菌操作稱取剪碎的水產樣品 25 g，加于 225 ml Demi-Fraser肉湯中， 30℃ 培養 24 小時后，吸取 1 ml培養液于 10 mlFraser肉湯中，置30℃ 24小時進行第二次増菌培養。

2.4 分離和鑒定

用VIDAS LMO試條對樣品進行初篩:全自動快速免疫檢測儀(mini - VIDAS)的工作原理為酶聯熒光免疫反應。吸取第二次培養物500l注入準備好的 VIDAS LMO試條，按 START SECTION啟動鍵，待其自動出結果，陰性即可報告為未檢出單核細胞增生李斯特菌;陽性者則按照國標法(GB/T 4789.30-2008第一法)進行分離培養和鑒定，本實驗選擇API Listeria生化鑒定試劑盒對分離菌株進行鑒定。

3 結果與分析

對從1158份VIDAS LMO試條陽性的樣品中分離出來的典型和可疑菌株進行革蘭氏染色鏡檢，運動性觀察，動力試驗，過氧化氫酶，氧化酶試驗，溶血試驗和 API Listeria 鑒定試驗。經鑒定，在 1158個樣品中，有11個(0.95 %)為李斯特氏菌屬陽性，其中 7個(0.60 %) 為單核細胞增生李斯特氏菌陽性。在170個凍羅非魚片樣品中，5個(2.94%)為李斯特氏菌屬陽性，其中4個(2.35%)為單核細胞增生李斯特氏菌陽性;在314個凍熟帶頭蝦樣品中，2個(0.64 %) 為李斯特氏菌屬陽性，其中1個(0.32 %) 為單核細胞增生李斯特氏菌陽性;在220個凍熟鳳尾蝦樣品中，1個(0.45 %)為李斯特氏菌屬陽性，無單核細胞增生李斯特氏菌陽性;在284個凍熟蝦仁樣品中，3個(1.06 %)為李斯特氏菌屬陽性，其中2個(0.70%)為單核細胞增生李斯特氏菌陽性;凍生帶頭蝦和凍去頭蝦樣品均無陽性(見表 1) 。

據報道，日本人對凍水產品污染單增李斯特氏菌的情況進行了調查，從2℃保存的貨物中抽取100個樣，其中有20(20%)個污染單增李斯特氏菌;從10℃保存的貨物中抽取65個樣品，有12(18.46%)個單增李斯特氏菌陽性。對40個凍水產品加工廠進行了單增李斯特氏菌的污染調查工作，發現有13(33%)個工廠的產品被單增李斯特氏菌污染;有25(63%)家工廠的車間污水檢出單增李斯特氏菌。調查數據表明，車間污水污染單增李斯特氏菌與凍水產品污染單增李斯特氏菌相關。本研究發現湛江地區水產品中單增李斯特氏菌污染率遠低于這一數值，這可能與該地區水產品加工(下轉第170頁)(上接第163頁)廠的環境衛生，車間污水處理情況及水產品加工廠在生產加工過程中部分使用了消毒劑等因素有關。本研究中也發現凍羅非魚片的單核細胞增生李斯特氏菌污染率高于其它樣品(表1)，這可能是凍羅非魚片在加工過程中與臺面及器具接觸的機會多，增加了交叉污染所引起的。

在被分離出的李斯特氏菌中，除部分被鑒定為單核細胞增生李斯特氏菌外，其它為L.i nnocua，L .welschimeri 和L.grayi，而其它李斯特氏菌未分離到。這一結果與 C. M.Franco 等人的研究報道相似。

本研究中，為了比較全自動酶聯熒光免疫分析儀篩選法和API Listeria生化鑒定法兩種方法，先用VIDAS LMO試條對樣品進行初篩，然后對陽性樣品進行API Listeria鑒定，結果發現1158份樣品中，ViDAS LMO存在4個假陽性，見表2。

表1 1158份不同種類的凍水產品中李斯特氏菌污染率的比較

表2全自動酶聯熒光免疫分析儀篩選法和API Listeria生化鑒定法兩種方法的單核細胞增生李斯特氏菌檢出率比較

以上結果表明，在湛江地區進出口水產品加工廠加工的水產品中存在一定比例的單核細胞增生李斯特氏菌和李斯特氏菌屬的污染，在污染的李斯特氏菌屬中除單核細胞增生李斯特氏菌外，其它是L.innocua，L.welschimeri 和 L.grayi。

本次實驗結果與L.M .Graves等報道的“VIDAS系統檢測LMO的敏感性和特異性均為 100 %”的結論有一定的差異，API鑒定結果為L.innocua、L.welschimeri和 L.grayi的樣品其VIDAS LMO測定結果卻呈陽性，筆者認為出現假陽性的原因有兩種可能，一是這些菌株與LMO有某些抗原交叉，二是該菌株中存有非特異性物質。當然，這里面的原因是相當復雜的，有待于進一步探討。

參考文獻

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