pIRES2-EGFP-hIL-10真核表達載體的構建及鑒定

[摘要] 目的 構建帶有報告基因EGFP的hIL-10真核表達載體。方法 通過RT-PCR方法從人外周血淋巴細胞中擴增出IL-10基因，構建IL-10基因和報告基因EGFP基因真核表達載體pIRES2-EGFP-hIL-10，經PCR、酶切、測序等方法進行鑒定，紫外分光光度計測定質粒濃度及純度。結果 酶切、PCR及測序證實pIRES2-EGFP-hIL-10載體序列正確。結論 成功構建真核表達載體pIRES2-EGFP-hIL-10，可為后續器官移植免疫耐受的研究奠定基礎。

[關鍵詞] 基因;IL-10基因;真核表達載體;載體構建

[中圖分類號] Q754[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701(2009)34-01-03

Construction and Identification of pIRES2-EGFP-hIL-10 Plasmid

CHEN Lihong1LIU Jingfeng2FANG Hangrong1QIU Minglian2

1.Department of Pathology，Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China;2.The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China

[Abstract] Objective To construct the pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid of human. Methods IL-10 gene was amplified from human peripheral blood lymphocytes by using RT-PCR，and then pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid was constructed. The identification was done by using endonuclease cutting，PCR and sequencing and the plasmid concentration and purity were detected by using UV spectrophotometer. Results Endonuclease cutting. PCR andsequencing showed the successful construction of pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid.Conclusion We construct pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid successfully and lay the foundation for immunotolerance researchesin the organ transplantation.

[Key words] Gene;IL-10 gene;Eukaryotic expression vector;Vector construction

白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)是最初由Mosman等1989年發現的一種由Th2分泌的細胞因子，它能抑制Thl細胞因子的分泌。近來，越來越多的研究表明IL-10具有抑制免疫活性細胞的激活和細胞因子產生的作用，與移植物排斥有密切關系，因此在器官移植領域，越來越多的研究表明，IL-10能通過多種途徑來抑制或減輕排斥反應，從而延長移植物的存活時間。我們通過構建hIL-10真核表達載體為今后在器官移植免疫耐受的進一步實驗研究提供依據。

1材料與方法

1.1外周血單核細胞的制備

取正常人新鮮抗凝血5mL與Hanks液等量混勻后，加于4mL淋巴細胞分離液上，離心收集細胞，用5mL含10%的胎牛血清1640CM培養液懸浮，加入25mg/L的ConA，于37℃、5% CO2培養箱中孵育24h。

1.2RT-PCR擴增人IL-10基因

淋巴細胞經ConA刺激后，用Trizol試劑按說明書提取總RNA。逆轉錄體系為:模板RNA溶液5μL，5×RT buffer 4μL，dNTP(各10mmol/L) 混合物2μL，RNA酶抑制劑0.5μL，引物設計參照GenBank上人IL-10基因序列分別設計引物下、下游引物。上游引物:IL-10F:CCGCTCGAG CCACC ATGCACAGC TCAGCACTGCTCT，下游引物:IL-10R:CCGGAATTC TCAGTTT CGTATCTTCATTGTC。Oligo(dT) 引物1μL，AMV返轉錄酶1μL，DEPC水6.5μL。42℃保溫1h，置95℃溫育5min 使AMV逆轉錄酶失活。將此反轉錄產物直接進行PCR。目的片段大小約540bp。PCR反應條件:94℃預變性2min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環，最后72℃延伸10min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(100V，30min)，凝膠成像系統攝像。

1.3真核表達載體pIRES2-EGFP-hIL10的構建

1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收PCR產物，連同pIRES2 -EGFP空載體，經Xho I和EcoR I 雙酶切后，T4 DNA 連接酶4℃過夜連接，連接產物按常規方法轉化于DH5a 感受態細胞。挑取單克隆菌落進行擴增培養，采用HiSpeed Plasmid Midi Kit 質粒純化試劑盒(QIAGEN公司)抽提質粒，詳見說明書。

1.4真核表達載體pIRES2-EGFP-hIL10鑒定

1.4.1限制性內切酶酶切、電泳及片段回收取IL-10質粒抽提產物用(CTCGAG CCACC ATG)和(GAATTC TCA)雙酶切，反應體系:Xho I 1μL，EcoR I 1μL，10×K Buffer 2μL，重組質粒(118μg/mL)5μL，滅菌雙蒸水11μL，反應混合液混勻后置37℃酶切過夜后，1%瓊脂糖電泳(100V，30min)凝膠成像儀成像。

1.4.2PCR法鑒定hIL-10目的基因片段IL-10基因上游引物:5 ATGC ACAG CTCA GCAC TGCT CT 3，下游: 5 TCAG TTTC GTAT CTTC ATTG TC 3，預期產物大小為450bp。

反應總體積25μL，反應體系如下:10×Buffer 2.5μL，滅菌雙蒸水17.375μL， dNTP mixture(各2.5mM)2μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，菌液1μL，Taq(5U/μL)0.125μL，總體積25μL。PCR反應條件:94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環，最后72℃延伸7min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(100V，30min)，凝膠成像系統攝像。

1.4.3測序取質粒抽提產物1mL，用通用引物送博亞公司測序。

2結果

2.1hIL-10基因的PCR產物電泳分析

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，PCR擴增產物均為一條帶，對比Marker，大小同預期結果一致(圖1)。

2.2重組質粒的酶切鑒定

紫外燈下定位切取所需DNA片段凝膠條，重組質粒pIRES2 -EGFP-hIL-10酶切后顯示2kb和540bp兩個條帶(圖2)。

2.3重組質粒測序鑒定

重組質粒pIRES2-EGFP-hIL-10抽提產物測序結果(圖3)，經Genebank的序列比對，兩重組目的基因序列完全正確。

2.4重組質粒的結構圖(圖4)

2.5紫外分光光度計測定中量抽提質粒確定濃度及純度(表1)

3討論

白細胞介素10(Interleukin10，IL-10)最初于1989年由Fiorentino等發現，他們證明IL-10由Th2淋巴細胞和單核細胞合成分泌，具有抗炎和抑制多種細胞因子合成的作用，所以稱之為細胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor，CSIF)[1]。人IL-10(hIL-10)基因定位于第一號染色體上，編碼178個氨基酸，其中含18個氨基酸疏水信號序列，成熟蛋白含160個氨基酸。IL-10的生物學功能主要有IL-10能抑制抗原特異的T細胞增殖和分泌致炎細胞因子。IL-10能直接作用于T細胞上的CD28協同刺激受體，阻斷CD28酪氨酸磷酸化過程和CD28分子介導的信號傳導通路，從而有效抑制T細胞的增殖和細胞因子的產生，誘導T細胞耐受。此外，IL-10還可以通過特異的抑制T細胞IL-2的分泌而抑制T細胞的增殖[2]。IL-10這種抑制T細胞分泌IL-2，TNF-α，IFN-γ的作用可使機體的遲發性變態反應受到抑制。此外，IL-10通過抑制IFN-γ的產生抑制NK細胞的活性。它對單核細胞和巨噬細胞的影響也主要是抑制性的。總之，IL-10的這些生物學活性顯示其為一種潛在的免疫增殖反應和炎癥反應的負性調節因子[3-6]，是一種針對同種異體器官移植的有益的細胞因子。

目前的轉基因載體主要分為病毒載體系統和非病毒載體系統。其中病毒載體較有效，是目前基因治療的主要手段，但病毒載體存在一些缺陷，包括安全性、免疫原性、對靶細胞有一定的毒性、非導向性。有限的攜帶能力，生產和包裝問題、成本高昂等，限制了其推廣應用。非病毒類價格比病毒低廉且安全，較少產生抗原性[7]。

熒光蛋白標記技術是近年來迅速發展的一種新型細胞示蹤技術，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 基因片段較小，易于構建融合蛋白，本實驗中選用的pIRES2-EGFP表達載體，進入靶細胞后，具有安全性好，容量大等特點。以增強型綠色熒光蛋白(EGFP)作為報告基因，使EGFP的熒光強度提高了35倍，而且轉染16～24h后仍可穩定表達，由于EGFP報告基因檢測非常方便，有別其他報告基因檢測需加入底物，具有直觀、及時、應用范圍廣的特點，是其他報告基因所無法比擬的。我們首先從人外周血分離得到淋巴細胞，通過分子克隆的手段得到了人IL-10基因，并成功的構建出帶有報告基因EGFP的pIRES2- -hIL-10真核表達載體，目的基因進行了序列測定和相似性比對，結果顯示與GeneBank基因序列完全一致。同時，酶切、PCR鑒定結果顯示構建成功。這將為下一步研究IL-10在誘導器官移植免疫耐受中的作用奠定前期基礎。

[參考文獻]

[1] Fiorentino DF，Bond MW，Mosmann TR. Two types of mouse T helper cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones[J]. J Exp Med，1989，170(6):2081-2095.

[2] 傅繼東. 白介素-10、樹突狀細胞及免疫耐受[J]. 國外醫學:免疫學分冊，2001，24(3):133-136.

[3] Steinbrink K， Graulich E， Kubsch S，et al. CD4(+) and CD8(+) anergic T cells induced by interleukin-10-treated human dendritic cells display antigen-specific suppressor activity[M]. Blood， 2002， 99(7):2468-2476.

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[7] Zhang Y，Sekirov L，Saravolac E，et a1. Stabilized plasmid lipid particles for regional gene therapy: formulation and transfection properties[J]. Gene Ther，1999，6:1438-1447.

(收稿日期:2009-09-11)