化學(xué)發(fā)光免疫成像分析法初探

陳賢瑜

摘要: 隨著化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的日趨成熟，各種技術(shù)與化學(xué)發(fā)光免疫分析的聯(lián)用成為一種發(fā)展趨勢(shì)。本文介紹了化學(xué)發(fā)光免疫分析主要類型及化學(xué)發(fā)光免疫分析聯(lián)用技術(shù)，重點(diǎn)對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫成像進(jìn)行了分析和研究。

關(guān)鍵詞: 化學(xué)發(fā)光；聯(lián)用技術(shù)；免疫成像

1化學(xué)發(fā)光免疫分析概述

化學(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光劑包括發(fā)光物質(zhì)或者發(fā)光反應(yīng)催化劑等直接標(biāo)記抗體或抗原的一類免疫測定方法。將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合起來，藉以檢測抗原或抗體的分析技術(shù)。將發(fā)光物質(zhì)或酶標(biāo)記在抗原或抗體上，免疫反應(yīng)后，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來測定發(fā)光標(biāo)記物或酶標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而確定待測抗原或抗體的濃度，它同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性，其主要的優(yōu)點(diǎn)在于:(1)高靈敏度:由于不需要外來光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而具有比熒光法更高的信噪比，其靈敏度比RIA或EIA高1至2個(gè)數(shù)量級(jí);(2)發(fā)光標(biāo)記物穩(wěn)定，有效期長，大多數(shù)發(fā)光標(biāo)記物可保存數(shù)月甚至數(shù)年;(3)檢測范圍寬;(4)自動(dòng)化程度高，不僅可以大大提高檢測工作效率，而且避免了手工操作可能帶來的誤差，提高了分析方法的精密度。

根據(jù)其標(biāo)一記物的不同可分為三大類:標(biāo)記酶的化學(xué)發(fā)光免疫分析，其中應(yīng)用最多的是三種酶，依據(jù)HRP-Luminol-H202一對(duì)碘苯酚(PIP)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系進(jìn)行檢測的辣根過氧化物酶(HRP)，能催化AMPPD的分解反應(yīng)從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光進(jìn)行抗原抗體定量分析的堿性磷酸酶(ALP)，另一種是蟲熒光素酶，能催化氧化蟲熒光素產(chǎn)生發(fā)光而實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP、各種激素、藥物以及抗原抗體的定量分析:標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光免疫分析，最典型的是標(biāo)一記氨基異魯米諾(ABEI)和叮睫酷類的化學(xué)發(fā)光免疫分析:另一種是標(biāo)記熒光物質(zhì)，通過過氧化草酸酷化學(xué)發(fā)光體系進(jìn)行檢測的化學(xué)發(fā)光免疫分析。

2 化學(xué)發(fā)光免疫分析聯(lián)用技術(shù)

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光免疫分析(FI-CLIA)。流動(dòng)注射免疫分析(FIIA)是利用在非平衡態(tài)測定，使反應(yīng)時(shí)間縮短、更利于快速測定和自動(dòng)化。FI-CLIA在環(huán)境和臨床的應(yīng)用都已有許多文獻(xiàn)報(bào)道。20世紀(jì)80年代末至90年代初，Kramer等就開始研究流動(dòng)注射免疫分析應(yīng)用于環(huán)境中的殺蟲劑、除草劑的分析。利用FIIA是一種靈敏性、專一性、準(zhǔn)確性好，快速、節(jié)約成本的方法，樣品也不需要預(yù)處理和富集。Wittmann等用FIIA和纖維光學(xué)免疫傳感器兩種方法對(duì)水樣中2,4-D進(jìn)行測定。而且FIIA方法不需要對(duì)水樣預(yù)處理。GC/MS測定結(jié)果和FIIA測定數(shù)據(jù)具有良好的相關(guān)性。FIIA是一種集流動(dòng)注射的重現(xiàn)性好和免疫分析的特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)于一體的現(xiàn)代醫(yī)藥檢驗(yàn)方法，隨著流動(dòng)注射分析技術(shù)、免疫柱制備技術(shù)和抗原、抗體標(biāo)記技術(shù)的日臻成熟，其分析靈敏度、重現(xiàn)性和特異性將大大提高，既節(jié)約了分析時(shí)間，又降低了成本。目前，隨著其它現(xiàn)代分析技術(shù)的不斷發(fā)展，F(xiàn)IIA涌現(xiàn)出許多新技術(shù)和新方法。

高效液相色譜化學(xué)發(fā)光免疫分析法(HPLC-CLIA)。由于藥物和代謝物結(jié)構(gòu)之間的相似性，在免疫分析中出現(xiàn)假陽性，此時(shí)如果利用HPLC的分離技術(shù)對(duì)分子間微小差別的高識(shí)別能力，再和化學(xué)發(fā)光免疫分析相結(jié)合，可大大提高特異性，成為一種有效的痕量和超痕量分離分析技術(shù)。

化學(xué)發(fā)光免疫成像分析法(CLIAI)。化學(xué)發(fā)光免疫分析與成像技術(shù)聯(lián)用，形成化學(xué)發(fā)光免疫成像分析。成像技術(shù)是將某些特效反應(yīng)所釋放的能量通過電荷偶合裝置，用高分辨率的相機(jī)以積分的形式拍攝下來。它可提供直觀圖像、可用在不同空間層次或時(shí)間過程中，能產(chǎn)生光學(xué)圖像的動(dòng)態(tài)信息，當(dāng)與化學(xué)發(fā)光免疫分析法聯(lián)用，可用于抗原、抗體的測定，對(duì)生物分析、醫(yī)學(xué)臨床診斷等也顯得更為方便。利用化學(xué)發(fā)光免疫成像分析法進(jìn)行污染物如2, 4-D、乙酞膽堿醋酶和殘留農(nóng)藥的檢測以及親血色珠蛋白的分型等具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測快速、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，這為醫(yī)學(xué)、食品、水源等環(huán)境中有毒害物質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模、高通量、多元化、快速檢測提供可能。

3 化學(xué)發(fā)光免疫成像分析

化學(xué)發(fā)光免疫成像分析法盯是化學(xué)發(fā)光免疫分析與成像技術(shù)聯(lián)用而發(fā)展起來的一種既具有化學(xué)發(fā)光冤疫分析高靈敏度，又具有成像技術(shù)高通量優(yōu)勢(shì)，并能實(shí)現(xiàn)多樣品同時(shí)檢測的新方法。經(jīng)過不同模式的抗原抗體的免疫結(jié)合過程，加入化學(xué)發(fā)光底物，標(biāo)記在抗原抗體上的酶可以催化底物間的化學(xué)反應(yīng)，所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)用超靈敏的CCD進(jìn)行捕捉，并以積分的形式轉(zhuǎn)化成數(shù)學(xué)信號(hào)顯示出來。

CCD是基于金屬一氧化物一半導(dǎo)體(MOS)技術(shù)的光敏元件，它是一種以電荷量表示光量大小、用藕合方式傳輸電荷量的新型器件。新型CCD具有光電轉(zhuǎn)換效率高、波長相應(yīng)范圍寬、低溫下暗電流幾乎等于零、動(dòng)態(tài)線性范圍寬、陣列結(jié)構(gòu)的多通道同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)。這樣化學(xué)發(fā)光免疫成像分析既具有化學(xué)發(fā)光免疫分析高靈敏度、高特異性、發(fā)光標(biāo)記物穩(wěn)定、線性范圍寬、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，還具有成像分析高通量、能實(shí)現(xiàn)多樣品的同時(shí)檢測等優(yōu)勢(shì)。

化學(xué)發(fā)光免疫成像分析法按照抗原抗體包被載體的不同，可以分為化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板免疫成像分析，化學(xué)發(fā)光微陣列免疫成像分析和化學(xué)發(fā)光微全分析系統(tǒng)免疫成像分析。

3.1 化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板免疫成像分析

通過成像設(shè)備，很容易實(shí)現(xiàn)對(duì)酶標(biāo)板上產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)值的測定，且對(duì)于商業(yè)化的發(fā)光儀器，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多塊標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)板的同時(shí)成像。傳統(tǒng)的讀板器是一個(gè)孔一個(gè)孔讀板，記錄發(fā)光信號(hào)值，但發(fā)光成像儀可以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)酶標(biāo)板發(fā)光信號(hào)的一次性讀取，尤其對(duì)于高密度的孔板(384孔板或更多)，化學(xué)發(fā)光成像記錄發(fā)光信號(hào)值的速度更是大大快于傳統(tǒng)的讀板器。化學(xué)發(fā)光成像具有高分辨率的檢測設(shè)備，能夠避免相鄰發(fā)光反應(yīng)孔的干擾，這在高密度的孔板檢測中具有尤為重要的意義，但由于反應(yīng)孔存在深度，會(huì)產(chǎn)生陰影和光反射，這就會(huì)對(duì)不同位置的發(fā)光信號(hào)產(chǎn)生不同影響，但可以通過光校正加以消除。

化學(xué)發(fā)光成像分析法具有高靈敏度、樣品或者分析物需要量小，在高密度孔板分析中具有強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)等特點(diǎn)，因此它有助于分析方法朝高通量成像方向發(fā)展。

例如，A.Andreani對(duì)乙酞膽堿酷酶抑制劑進(jìn)行了化學(xué)發(fā)光免疫成像分析，采用384孔板可以在一個(gè)小時(shí)完成5000多個(gè)樣品分析。目前應(yīng)用最廣泛的是Luminol化學(xué)發(fā)光免疫成像體系，它已應(yīng)用在抗原抗體細(xì)胞因子、病毒、激素，腫瘤標(biāo)記物，重金屬離子等目標(biāo)分子以及實(shí)際樣品分析中。

3.2 化學(xué)發(fā)光微全分析系統(tǒng)免疫成像分析

成像檢測的高分辨率和高靈敏度是化學(xué)發(fā)光成像分析與微全分析系統(tǒng)相結(jié)合的主要原因，因?yàn)槲⑷治鱿到y(tǒng)的樣品用量小，因此更需要非常靈敏的檢測手段。例如與化學(xué)發(fā)光免疫成像分析檢測多種樣品中的2，4-D含量相比，加入了未激活的固相載體(如金包被的固體表面或者玻璃毛細(xì)管)，該固相載體具有所有固相載體的大部分優(yōu)點(diǎn)。采用間接ELSIA法，牛奶中抗生素的快速自動(dòng)化分析。三方向的流通生物芯片，由有序的玻璃微通道組成，發(fā)展成為化學(xué)發(fā)光檢測多組雜交過程。

3.3 化學(xué)發(fā)光微陣列免疫成像分析

微陣列技術(shù)允許上千種分析物質(zhì)的在單一實(shí)驗(yàn)中的同時(shí)分析，它的非凡力量是通過基因陣列表達(dá)分析實(shí)現(xiàn)的。通過配位結(jié)合反應(yīng)如抗原一抗體或配體一受體反應(yīng)建立的蛋白質(zhì)陣列，在醫(yī)學(xué)研究、診斷學(xué)、蛋白物質(zhì)和藥品發(fā)明中變得越來越重要。以化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)作為檢測手段，基于抗原抗體反應(yīng)的微陣列具有ELISA法的特異性、化學(xué)發(fā)光方法的高靈敏度和陣列分析法高通量的優(yōu)點(diǎn)。選擇高分辨率的成像設(shè)備是化學(xué)發(fā)光微陣列分析法得到更佳發(fā)展的必要選擇，因?yàn)槌上穹治隹梢詫?shí)現(xiàn)在大量分析物發(fā)光信號(hào)值的同時(shí)檢測。通過將抗體特異性結(jié)合到膜上，蛋白質(zhì)微陣列可用于抗體和細(xì)胞因子的多重檢測。該膜經(jīng)過在樣品或者分析物中孵育而結(jié)合了樣品或者分析物，然后用HRP標(biāo)記抗體和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光分析。該分析法不需要很復(fù)雜的設(shè)備，能實(shí)現(xiàn)多樣品的同時(shí)分析，并且具有高的特異性和靈敏度。Z. Sun等利用蛋白質(zhì)微陣列對(duì)12種腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行了化學(xué)發(fā)光免疫成像分析，并且提高了單一腫瘤標(biāo)記物檢測診斷方法的靈敏度和特異性。蛋白質(zhì)微陣列在身體檢查中的應(yīng)用表明了它在協(xié)助腫瘤診斷和高危人群的病癥診斷方面具有可行性。

參考文獻(xiàn)

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