苦豆和狼牙刺種子中苦參堿與氧化苦參堿含量的分析比較

江 珊 韓 豪 江 海 田 姍

摘要建立分析測定苦豆和狼牙刺種子中苦參堿與氧化苦參堿含量的高效液相色譜法,并對其含量進(jìn)行測定、分析、比較。結(jié)果表明:該色譜法能用于苦豆和狼牙刺種子中苦參堿和氧化苦參堿含量檢測,并測得其含量在苦豆和狼牙刺種子中各有優(yōu)勢;狼牙刺種子在氧化苦參堿制備方面有利用價值。

關(guān)鍵詞苦豆;狼牙刺種子;苦參堿;氧化苦參堿;含量

中圖分類號R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0017-02

苦豆(Sophoraalopecuroides L. )為豆科植物苦參的種子,又名苦參實(shí)、苦參子。廣泛分布于我國青海、甘肅、陜西、寧夏、內(nèi)蒙古等省區(qū)。主要含有苦參堿、氧化苦參堿,具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效[1-2]。

狼牙刺(Sophora viciifolia H.)為豆科槐屬多年生灌木,又名白刺花,廣泛分布于我國的河北、山西、陜西、甘肅、河南、四川、云南、貴州等省區(qū)。狼牙刺作為一種秦巴地區(qū)廣泛使用的民間藥材,已有悠久的歷史。據(jù)檢測分析,其種子中含有苦參堿(Matrine)、氧化苦參堿(Oxymatrine)等多種生物堿[3-5]。

現(xiàn)代藥理研究表明,以苦參堿、氧化苦參堿為代表的苦參類生物堿具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗心律失常、免疫調(diào)節(jié)和升高白細(xì)胞等作用[6-11]。漢中為苦豆和狼牙刺的適宜生長區(qū)之一,野生資源十分豐富。本文采用高效液相色譜法,對漢中野生苦豆和狼牙刺種子中的苦參堿、氧化苦參堿含量進(jìn)行了測定、分析,旨在建立一種分析測定苦豆和狼牙刺中苦參堿與氧化苦參堿的高效液相色譜法,并探討苦參堿與氧化苦參堿含量的差異,為合理開發(fā)利用苦豆和狼牙刺種子資源提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

苦豆和狼牙刺種子均采自陜西省漢中市西鄉(xiāng)縣桑園鎮(zhèn),于105℃烘箱內(nèi)烘干、粉碎,過40目分樣篩,備用。

1.2儀器

液相色譜儀(Agilent 1100,安捷倫公司);超聲波清洗儀(SK-120E,寧波科生儀器有限公司);紫外-可見分光光度計(UV-2550,島津公司);超純水器(TTL-10A,北京同泰聯(lián)科技發(fā)展公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(山東濰紡醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司醫(yī)療器械廠);中草藥粉碎機(jī)(FW117,天津市泰斯特儀器有限公司);十萬分之一分析天平(AUW220D,島津公司);萬分之一電子天平(FA2004N,上海分析儀器);恒溫水浴鍋(HWS-5A,北京東方精瑞發(fā)展有限公司)。

1.3試劑

甲醇為色譜純;氨水、氯仿、磷酸為分析純;水為超純水;對照品苦參堿(110805-200306)、氧化苦參堿(0780-200004)購于中國藥品生物制品檢驗(yàn)所。

1.4色譜條件

色譜柱ZORBAX -C18柱(4.6mm×150mm,5μm);檢測波長為220nm;流動相為0.04 moL/L磷酸-甲醇(90∶10);流速為1.0mL/min;柱溫為20℃。

1.5對照品溶液的制備

分別精密稱定苦參堿對照品2.4mg和氧化苦參堿對照品10.8mg,用超純水定容至10mL容量瓶中,制成含苦參堿2.4μg/mL及氧化苦參堿10.8mg/mL的混合對照品母液。

1.6供試品溶液的制備

精密稱取試驗(yàn)材料0.5g,置于60mL具塞三角瓶中,加入2mL濃氨水使樣品潤濕,再加入30mL氯仿,超聲提取30min,靜置4h,濾出上清液后再加氯仿超聲提取,共提取3次。合并3次濾液,80℃水浴回收氯仿至干。殘留物以超純水溶解,并定容于25mL容量瓶。

2結(jié)果與分析

2.1檢驗(yàn)波長選擇

取苦參堿和氧化苦參堿對照品適量,分別用超純水配成標(biāo)準(zhǔn)溶液,在UV-2550紫外-可見分光光度計上于190~900nm進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示,苦參堿和氧化苦參堿在220nm處有最大吸收,試驗(yàn)采用220nm為檢驗(yàn)波長。

2.2出峰時間確定

在上述色譜條件下,分別進(jìn)1.5中配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μL,檢測得苦參堿在4min處出峰,氧化苦參堿在9min處出峰。

2.3線性關(guān)系的考察

精密量取混合對照品母液0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.00 mL、3.00mL用超純水定容至5.0mL容量瓶,得到苦參堿濃度梯度為12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL、96μg/mL、192μg/mL和氧化苦參堿濃度梯度為54μg/mL、108μg/mL、216μg/mL、432μg/mL、648μg/mL的一組混合對照品溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,在色譜設(shè)定條件下依次進(jìn)樣10μL測定苦參堿、氧化苦參堿的峰面積。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得線性回歸方程。苦參堿的方程為Y=5.013 7 X+7.814,r=0.999 70;氧化苦參堿的方程為Y=5.499 X+4.53,r=0.999 92。結(jié)果見圖1。供試品溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后,在設(shè)定色譜條件下,取供試品溶液10μL進(jìn)樣測定。結(jié)果見圖2。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述供試樣品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,利用外標(biāo)法測定樣品中苦參堿、氧化苦參堿濃度,RSD分別為0.245%、0.204%。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取上述供試樣品溶液10μL,分別在2h、4h、8h、24h、48h進(jìn)樣,測定苦參堿、氧化苦參堿的濃度,RSD分別為0.326%、0.204%。結(jié)果表明,供試品溶液中的苦參堿、氧化苦參堿在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一材料,按供試品溶液的制備方法平行制備5份,依上述方法測定苦參堿、氧化苦參堿濃度,RSD值分別為0.404%、0.311%。

2.7回收率試驗(yàn)

精密稱取已測定苦參堿、氧化苦參堿含量的樣品5份,每份0.5g,分別加入定量的苦參堿、氧化苦參堿,按供試品溶液的制備方法制備,測定,結(jié)果如表1。得苦參堿的平均回收率為100.990%,RSD值為2.122%;氧化苦參堿的平均回收率為99.180%,RSD值為0.098%。

2.8樣品含量測定

分別取苦豆和狼牙刺種子為試驗(yàn)樣品,按供試樣品溶液制備的方法處理樣品。分別精密吸取各供試樣品溶液10μL,進(jìn)樣分析檢測,計算得苦豆和狼牙刺種子中苦參堿和氧化苦參堿含量(見表2)。

3討論

3.1色譜條件

試驗(yàn)分別用0.2%鹽酸提取法、甲醇提取法和氨水-氯仿提取法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用0.2%鹽酸提取法在蒸干時困難;甲醇提取法出現(xiàn)絮狀物,檢測困難;氨水-氯仿提取法溶液澄清,重復(fù)性好。

分別采用甲醇、乙醇、超純水定容對照品和樣品材料的提取物,進(jìn)行分析測定。用超純水定容的待測樣色譜圖基線穩(wěn)定,峰形對稱,重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,可用于定性、定量分析檢測,為本試驗(yàn)最終選擇。

試驗(yàn)采用酸性流動相,出峰時間短,且隨流動相pH值的減小,峰形對稱性越好,基線越平直。考慮到酸性對設(shè)備的使用壽命的影響,最終采用0.04moL/L磷酸溶液(pH值1.8)-甲醇為流動相,并采用能耐受酸性環(huán)境的ZORBAX-C18(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱,檢測效果良好。

3.2含量分析比較

從苦豆和狼牙刺種子中的苦參堿和氧化苦參堿含量測定結(jié)果可以看出,狼牙刺種子更具優(yōu)勢。在制備以苦參堿和氧化苦參堿為主的生物產(chǎn)品時,可以適當(dāng)考慮用狼牙刺種子作為材料。苦豆作為一種中藥材已有廣泛運(yùn)用,狼牙刺種子苦參類生物堿雖然含量高,但能否可當(dāng)作廣泛使用的中藥材還需進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上海人民衛(wèi)生出版社,1985.

[3] 蔣冬梅.白刺花未成熟果實(shí)生物堿成分提取[J].海南醫(yī)學(xué)院報,2000, 3(3):161-164.

[4] 閻玉凝,王秀坤.白刺花的花中生物堿成分的研究[J].中國中藥雜志,1996,21(4):232-233.

[5] 王秀坤,李家實(shí).白刺花幼果生物堿成分的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,1996,19(5):66-69.

[6] 陰健,郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].北京:學(xué)苑出版社,1994.

[7] 李丹,王平全,張楠森,等.苦參堿類生物堿的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J].中草藥,1996,27(5):308.

[8] 焦霞,沈其韻,王利民,等. 氧化苦參堿對哮喘小鼠抗炎作用的研究[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2002,22(4):303-305.

[9] 張紅菱.氧化苦參堿對四氯化碳損傷大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用[J]. 武漢工業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002,5(3):273-275.

[10] 陳偉忠,林勇,謝渭芬.苦參堿抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院學(xué)報,2002,1(3):4-6.

[11] 黃彩云,謝世榮,黃勝英,等. 苦參堿抗心率失常作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2002,24(3):177-179.

[12] 劉荷中.治療性丙型肝炎疫苗研究新進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2002, 11(6):447-450.

[13] 張杰,左之文,向大雄,等.HPLC測定椿乳凝膠中苦參堿[J].中成藥,2005,27(9):1105-1106.