根癌農桿菌介導的植物遺傳轉化研究

劉立全 楊劍超 張 衡 楊 菲

摘要介紹了農桿菌介導的植物原位轉基因方法發展狀況、技術環節以及在轉化機制上的研究結果,并對存在的問題以及應用前景進行了討論。

關鍵詞根癌農桿菌;植物;遺傳轉化

中圖分類號 Q943.2 文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0143-01

1根癌農桿菌介導的基因轉化原理

野生型根癌農桿菌是一種土壤病原細菌,它通過根部傷口侵入植物體,刺激寄主在侵染部位形成冠癭瘤,引發根癌病。該病在世界范圍內普遍發生,患病植株株體衰弱,嚴重時整株死亡,在生產上危害極大。冠癭瘤的形成是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質Ti質粒上的一段DNA(T-D NA)轉移到植物細胞,整合到染色體組并進行表達的結果。這種具有天然轉基因功能的質粒,改造后,在基因工程中可以用作基因轉移的載體。根癌農桿菌中誘導植物產生腫瘤的質粒,簡稱Ti質粒。野生型根癌農桿菌的Ti質粒含有2個與致瘤有關的區域:一個是T-DNA區,含有致瘤基因;另一個是毒性區,在T-DNA的切割、轉移、整合過程起作用,用于植物基因轉化的農桿菌Ti質粒中致瘤基因刪除,并在T-DNA區域插入適當的選擇標記和多克隆位點。

2根癌農桿菌介導的基因轉化的特點

2.1導入基因拷貝數低,表達效果好

農桿菌介導的轉化向植物細胞導入的外源基因拷貝數大多只有1~3個,而其他方法往往會有幾十個,大量拷貝會導致轉基因的沉默。

2.2轉化頻率高

T-DNA鏈在轉移過程中受到蛋白質的保護及定向作用,可免受核酸酶的降解,從而完整、準確地進入細胞核,轉化效率較高。

2.3導入植物細胞的片段確切,且能導入大片段的DNA

Ti質粒上位于2個邊界序列之間的外源基因片段均會轉移到植物細胞,可避免其他理化方法將非目的基因片段導入植物細胞而造成潛在遺傳物質擴散的危險。

3影響農桿菌轉化效率的因素

3.1受體的來源及發育狀態

應該選擇活躍分裂的功能細胞,如愈傷組織胚性細胞、幼胚等,這些細胞處于良好的脫分化狀態,DNA合成能力強,有利于T-DNA的整合。

3.2農桿菌菌株的選擇與質粒的構建

超毒力的農桿菌菌株和超毒雙元載體,能夠增強農桿菌的侵染能力和T-DNA的整合能力,較好地克服農桿菌對單子葉植物敏感性差的問題。

3.3 vir基因活化物的使用

單子葉植物特別是禾本科植物受傷后分泌的誘導物質不足以形成有效的的信號,誘導農桿菌vir基因的表達。在共培養的培養基中,添加一定量的酚類化合物,能夠取得良好的效果。

4根癌農桿菌轉化應用范圍與方法的拓展

4.1單子葉植物的轉化

最早成功的轉化是Bytebier等人用含有nos-nptI基因的重組Ti質粒感染石刁柏愈傷組織,并且獲得抗卡那霉素的再生植株。

4.2真菌的轉化

Bundock等人成功轉化了酵母、木霉、曲霉、鐮孢霉、刺盤孢霉、脈孢霉以及傘菌等多種絲狀亞菌。真菌的成功轉化尋找到一種新的真菌基因工程改造方法,可作為研究宿主與T-DNA轉化互作關系的較好的分子體系。

4.3 裸子植物的轉化

由于受到外植體培養、轉化和選擇頻率等影響,Ti質粒轉化裸子植物一直受到限制。1999年Wenck等人使用含有附加拷貝virG和(virD+virB)基因的Ti質粒轉化挪威云杉,獲得100多個Gus表達株系,從而建立了裸子植物的轉化體系。

5根癌農桿菌轉化應用中存在的問題

5.1轉化機理方面

在轉化過程中,農桿菌本身的分子調控研究比較深入,但是有關植物因子的了解尚處于初級階段。此外,農桿菌介導的轉化過程T-DNA往往是單或者低拷貝整合的原因尚不清楚。

5.2轉化策略方面

向植物體內導入大片段DNA的工作有待深入,尤其是有重要經濟價值的禾谷類和豆科植物大片段DNA轉入的研究還未見報道。

5.3轉化方法方面

現今農桿菌介導的單子葉和谷類植物的轉化基本以幼胚為起始材料,取材受到生長周期限制。因此,實踐上迫切需要發展一些容易并且能夠經常大量獲得的外植體的農桿菌轉化體系,不需要組培而直接獲得轉基因植株的方法將十分有意義。

6參考文獻

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