禽流感病毒的分子生物學研究進展

薛金艷 王清路 竇 燁 李俏俏

摘要禽流感(AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的禽類烈性傳染病。它不僅給世界養禽業造成了巨大的經濟損失,而且對人類健康和生命安全構成了嚴重威脅。因此,禽流感已經成為人們關注的焦點。從病原基因組及其編碼的蛋白質、致病力、變異性以及對AIV的分子診斷等角度就AIV的分子生物學研究進行綜述,為防治AI提供理論基礎。

關鍵詞禽流感病毒;基因組;變異性;分子診斷;研究進展

中圖分類號 R51 文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0216-02

禽流感(Avian influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性或呼吸器官性傳染病,國際獸疫局(OIE)把該病定為A類烈性傳染病。禽流感病毒(Avian influenza vi- rus,AIV)典型的病毒粒子為球形,直徑80～120nm,有時呈絲狀體等多形態,至今A型流感病毒的血凝素已發現有16種,神經氨酸酶有10種。其血清型較多,容易變異。常發生在禽,有時也發生在低等哺乳類動物,至今在人僅有偶發病例。禽流感病毒根據其對雞致病性的不同分為高致病性、中致病性和低/非致病性。禽流感病毒不僅會給養禽、畜牧業帶來災難性的破壞,而且對公共健康也構成了嚴重威脅。

1AIV基因組及其編碼蛋白的功能

1.1AIV基因組

AIV基因組為單股負鏈RNA,共有8個獨立的RNA節段。通過對某些毒株8個節段的測序,發現它們存在一些共同的特點,即所有基因節段的5′端前13個核苷酸均相同,3′端也有12個高度保守的核苷酸,另外在每一節段靠近5′端15～21位核苷酸處有一保守區。其序列為PolyU。這一序列可以在病毒mRNA合成時產生PolyA。

1.2病毒的蛋白

1.2.1血凝素(Hem agglutinin,HA)。HA是流感病毒囊膜纖突的主要成分之一,是基因表達產物中最大的糖蛋白,為誘生保護性免疫的主要抗原,HA在病毒吸附及穿膜過程中起關鍵作用,刺激機體產生的中和抗體,可中和病毒的感染力,抵抗病毒的感染和發病。它是A型流感病毒毒力的主要決定因素。

1.2.2神經氨酸酶(Heuram in idase,NA)。NA由病毒核糖核酸(vRNA)片段6編碼,是另一個主要的表面抗原,其成熟的形式是具有催化活性的四聚體,能將唾液酸從糖蛋白和糖脂中切開。其作用是水解細胞表面的特異性糖蛋白末端的N—乙酰基神經氨酸。避免病毒粒子的聚集,有利于病毒的釋放,對病毒在感染細胞周圍的擴散能力有很大影響。

1.2.3核蛋白(Nucleo protein,NP)。NP是由片段5編碼的結構蛋白。主要功能是使病毒RNA(vRNA)形成核糖核蛋白復合體,以此來穩定vRNA,使其免受核糖核酸作用。另外,NP在病毒基因組的轉錄和復制以及決定病毒的宿主特異性方面都有重要的作用,而且它是細胞毒性淋巴細胞識別的主要抗原。

1.2.4基質蛋白(Matrix protein,MP)。第7節段RNA編碼的蛋白被稱為M1,部分分子量較小的蛋白稱為M2。M1構成病毒的基質膜,具有型特異性,其抗原性的差異也是流感病毒分型的依據之一。另外,M1在子代病毒粒子的裝配方面也有一定的作用。M2是一種跨膜蛋白,其作用是在HA合成過程中作為離子通道控制高爾基體內的pH值,在病毒脫殼時酸化病毒粒子的內部環境。

1.2.5聚合酶蛋白(PB1、PB2、PA)。A型流感病毒的聚合酶蛋白由PB1、PB2、PA等3種成分組成。這3種蛋白質的共同特點是含有一特異的親核序列區,其作用是使這幾種蛋白質在胞漿合成后能順利進入細胞核。其中,PB2、PB1與合成互補RNA有關,而PA、核蛋白與病毒的RNA合成有關。

1.2.6非結構蛋白(Non-structural proteins,NS)。A型流感病毒的結構蛋白由片段8編碼。片段8也有2個編碼框,可編碼2種蛋白質即NS1和NS2。NS1和NS2 兩種非結構蛋白的編碼區是基因組中最小的RNA片段。NS1和NS2相互間有70個氮基酸重疊,分別由不同的mRNA翻譯,提示它們由不同讀碼框架翻譯。在早期感染中NS1合成并在細胞核內積聚,磷酸化的NS1蛋白在病毒的復制過程中起調節作用;NS2主要在晚期感染中出現,并主要在胞漿中存在,目前它的功能還沒有徹底搞清。

1.2.7其他蛋白質(HE、M3、NB)。由基因節段7編碼,明確的功能還不清楚。

1.3AIV毒力變異的分子基礎

AIV很容易發生變異,誘發AIV發生變異的主要機理有抗原性變異,即抗原漂移(Antigenic Drift)和抗原轉變(Antigenic Shift)。在甲型流感病毒中,抗原漂移主要是由HA或NA基因發生點突變引起的,其中HA基因的變異率最高。每個核苷酸在每個復制周期中的變異率可高達2.0%。一般認為,來自宿主的免疫壓力是HA和NA抗原漂移的主要原因。由于突變幅度較大或各節段RNA間發生的重排導致抗原性發生大轉變導致新病毒亞型的產生,這種變異稱為抗原轉變。大量試驗證明,不同亞型病毒同時感染1個細胞時,病毒基因組可發生節段間的交換。理論上講,8個RNA片段存在256個不同的組合方式。事實證明,在自然界中經常有混合感染導致基因重組的事件發生。

2AIV的分子診斷

2.1血清學診斷技術

血清學診斷技術是從禽類體內采集血液析出血清后,檢測血清中抗體的有無和滴度變化,如瓊脂凝膠擴散試驗(AGID)、細胞凝集抑制試驗(HI)。AGP試驗鑒定病毒或檢測特異性的血清抗體或基質蛋白MP(Matrix protein)、特異性核蛋白NP。血細胞凝集試驗(HA)和血細胞凝集抑制試驗(HIT)鑒定病毒或血清抗體的亞型,神經氨酸酶抑制試驗(NI)鑒定病毒或血清抗體亞型等。

2.2RT-PCR分子診斷技術

崔尚金等(1998)建立了一種能夠直接檢測禽糞和雞胚尿囊液中H亞型禽流感病毒RNA的RT-PCR檢測方法。檢測過程僅需8h,不僅具有高度的敏感性和特異性,還可大大縮短對禽流感病毒的檢出時間。而應用毛細管PCR(15 min,30個循環)代替常規PCR(2.5h,30個循環)進一步縮短檢測時間的研究也已展開。并進入更深層次的領域,以期用于不同樣品的檢測,使該方法更加適用于禽流感病毒的臨床早期診斷。該技術在特異地檢出H或H亞型禽流感病毒同時,還可根據應用特定引物經RT-PCR擴增出的H和H包括裂解位點在內的HA基因片段。經測序推導出的氨基酸序列,判斷H或H亞型禽流感病毒的致病性高低。

2.3酶免疫測定(EIA)技術

EIA技術在AI的診斷與監測方面已被廣泛采用。Doller等建立了一種從鼻咽分泌物中直接檢測流感病毒抗原的酶免疫方法,該方法無須對病料進行超聲處理,而且在4h即可出結果。Cherian等建立了一種用于檢測呼吸道分泌物中A型流感病毒RNA的PCR酶免疫(PCREIA)方法。該方法對感染后4d的病料A型AIV的檢測特別有效。Schweiger等建立了用于檢測A型AIVN1和N2型的DNA酶免疫(DEIA)方法。該方法簡單、快速,可進行大批樣品的檢測。

2.4熒光PCR法

熒光RT-PCR技術是20世紀90年代末發展起來的新技術,將熒光素標記的探針與引物一起,在熒光PCR儀中反應,電腦對整個反應進行實時監測,避免了交叉污染,提高了檢測敏感性,已成功用于人乙型肝炎病毒、衣原體、艾滋病病毒等的檢測,根據A型禽流感病毒的共有NP基因序列設計引物、探針,建立的通用型熒光RT-PCR檢測方法不僅能夠用來檢測禽流感病毒H5、H7、H9亞型,而且對其他禽流感病毒亞型也能檢出。用通用型探針、引物檢測常見其他禽類病毒,未發現交叉反應。說明該方法敏感性高、特異性強。

2.5核酸探針技術

核酸分子雜交技術是目前生物化學和分子生物學研究應用最廣泛的技術之一,是定性和定量檢測特異性DNA或RNA的有力工具。用PCR技術制備了核蛋白基因片段(NPC)的地高辛標記cDNA探針,建立并優化了檢測AIV的探針雜交法。該探針具有較好的特異性和敏感性,為從分子水平探討禽流感的發病機理和臨床早期快速診斷提供了新的研究手段。對以基因芯片技術為基礎的檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒的診斷技術進行了研究,結果表明,DNA芯片技術可以提供一種有效的AIV診斷方法。

3結論

禽流感是一種全球性的烈性傳染病,可在宿主中不斷發生變異和基因重組,是2l世紀我國養禽業將面臨的最大的瘟疫性威脅。禽流感可在禽、豬和人中進行傳播。AIV不僅作為人流感的最大基因庫而間接威脅人類健康,而且還可作為人類的新病毒而直接構成人類的威脅。因此,預防禽流感具有重要的公共衛生意義和經濟意義。隨著現代分子生物學、微生物學、免疫學等學科的發展,以及同其他學科間的滲透,禽流感的傳統檢測診斷技術將與現代分子生物學技術結合或者現代分子生物學技術與其他學科研究技術有機結合,一定會實現診斷的快捷、方便、準確、靈敏、經濟、易操作,為禽流感的防治做出重大貢獻。

4參考文獻

[1] 李莉萍,韋平,韋天超,等.禽流感病毒的分子生物學特性及其檢測技術的研究進展[J].廣西農業生物科學,2005(1):10-12.

[2] 馮玉萍,馬忠仁.禽流感病毒(AIV)的特征與防治[J].西北民族大學學報(自然科學版),2004(1):69-72.

[3] 張家誰,徐紅.禽流感病毒致病性研究進展[J].病毒學報,2007(4):335.

[4] 牟維東,王永靈.禽流感的研究進展[J].中國獸醫科技,2004(4):32-37.

[5] 李建麗,馬仲彬,王澤霖,等.禽流感病毒遺傳變異及其分子機制[J].中國動物檢疫,2004(6):44-46.

[6] 鄭騰,陳枝華.禽流感病毒致病性的分子生物學基礎及研究近況[J].黑龍江畜牧獸醫,2002(2):41-43.

[7] 金元昌,李景鵬,張龍,等.禽流感病毒分子生物學研究進展[J].動物醫學進展,2003(1):12-15.

[8] (美)B.W.卡爾尼克.禽病學(第10版)[M]//高福,蘇敬良,譯.北京:中國農業出版社,1999.

[9] 衣翠玲.禽流感病毒的研究進展[J].青海畜牧獸醫雜志,200l(4):451.

[10] 魏泉德,譚愛軍.禽流感病毒實驗檢測研究進展[J].微生物學通報,2007(5):986-990.

[11] 宋曉暉,王中力,陳西釗.禽流感診斷研究進展[J].中國動物檢疫,2003(11):45-47.

[12] 傅生芳,獨軍政,?；菔|,等.禽流感病毒的分子生物學研究進展[J].動物醫學進展,2005(5):22-24.

[13] ROBINSON H L,HUNT L A,WEBSTER R G. Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a hemagglutinin expressing plasmid DNA[J].Vaccines,1993(11):957-960.

[14] THOMAS R,ROBERT A A,JEAN H,et al. Detection of antibody to avian influenza A(H5N1)virus in human serum by using a combination of serologic assays[J]. Clinmicrobiol,1999,37(4):937-943.