雞傳染性法氏囊病病毒福建株的分離與初步鑒定

俞伏松

摘要從臨床表現胸腿肌出血、法氏囊腫大出血為主要特征的病死雞肝脾和法氏囊中分離到1株病毒(IBDV-FJ)。結果表明,該分離病毒無血凝性,在瓊脂擴散試驗中能與抗IBDV特異性血清出現1條清晰的白色沉淀線;人工感染28日齡雛雞出現與臨床一致的病變,并回收到病毒;應用針對IBDV VP3基因的特異性引物進行RT-PCR,能擴增到長度為1 041bp的特異性目的片段;序列分析發現分離毒VP3基因與IBDV超強毒和經典毒株的核苷酸同源性分別為97.7%～98.2%和95.2%。初步鑒定該分離毒為雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株。

關鍵詞雞傳染性法氏囊病病毒;超強毒株;分離;鑒定

中圖分類號S851.34+7.2文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0218-02

傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是1種危害幼齡雞的急性、高度接觸性免疫抑制性傳染病,3～6周齡雛雞最易感,7日齡內雛雞感染可引起嚴重的免疫抑制,導致感染雞對其他疫苗的免疫失敗。1979年在我國北京郊區發現該病[1];1980年周蛟等從北京進口的雞群中分離到IBD-CJ801株[2],隨后全國各地陸續有該病發生和流行的報道;1985年,在美國Delmarve家禽生產地區發現了1個變異株,它能逃脫標準疫苗株母源抗體的保護;1989年,Ch- ettle等在荷蘭分離出高致病力的IBDV毒株(very virulent inf ectious bursal disease virus,vvIBDV);近年來國內也報道了vvIBDV的流行[3-6]。

2007年福建省某雞場35日齡2 000多羽免疫雞群突然發病死亡,發病率和死亡率分別達73%和52%,剖檢變化主要為胸肌和腿肌條狀出血;法氏囊明顯腫大為正常法氏囊的2~4倍,有的外觀呈紫葡萄狀,切開后可見內側皺褶面出血,有的可見干酪樣物質或炎性分泌物,腎腫脹、尿酸鹽沉積,脾臟腫大,表面斑駁。經免疫熒光試驗檢測,初步診斷為雞傳染性法氏囊病。故無菌采集病雞法氏囊、肝脾等組織進行病毒分離與鑒定,現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1試驗動物和血清

9～10日齡SPF雞胚購自福建省生藥廠;28日齡雛雞為非免疫健康雞并經AGP檢測母源抗體陰性;抗IBDV陽性血清購自中監所;抗IBDV單抗由福建省農科院畜牧獸醫研究所動物病毒研究室提供。

1.2受體菌、質粒載體和主要試劑

E.coil JM109菌株由福建省農科院畜牧獸醫研究所動物病毒研究室提供;T4DNA連接酶、pMD18-T載體、鼠源反轉錄酶(M-MLV)、RNA酶抑制劑(RNasin)、rTaq聚合酶、Trizol試劑盒購自寶生物工程有限公司(大連);DNA膠回收試劑盒與質粒快速提取試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。

1.3病毒分離

1.3.1病料采集與處理。無菌采集具典型病變的病死雞法氏囊及肝脾,加Hanks制成20%勻漿,凍融3次,4 000rpm離心15min,取上清液加青霉素、鏈霉素各1 000IU/mL,置4℃冰箱中過夜處理備用。

1.3.2雞胚接種。取上清液,經絨毛尿囊膜接種9～10日齡SPF雞胚,每胚0.2mL。收集48～120h的死胚尿囊液和胚膜混合勻漿,離心取上清液即為分離毒記IBDV-FJ。

1.4病毒鑒定

1.4.1人工感染試驗。分離毒經點眼、滴鼻接種28日齡雛雞4只,每只0.2mL,同時以健康雛雞為對照,隔離飼養。觀察發病死亡情況,并收集病死雞法氏囊,用于制備AGP抗原和回收病毒。

1.4.2AGP抗原制備。采集人工感染病死雞法氏囊,用生理鹽水作1∶4勻漿處理,置冰箱中凍融3次,離心,取上清液即為分離毒AGP抗原。

1.4.3瓊脂擴散試驗。制備厚3mm 1%瓊脂(含8%NaCl)平板,按常規打孔,中央孔加標準抗IBDV陽性血清,周圍孔加分離毒AGP抗原,置濕盒中37℃過夜,觀察結果。

1.4.4免疫熒光試驗。取臨床采集或人工感染病死雞法氏囊制成6μm厚的冰凍切片,用冷丙酮固定10min,加抗IBDV單抗,置濕盒中37℃ 30min,再加FITC標記的羊抗鼠-IgG 30min,洗滌后以甘油-PBS封片。熒光顯微鏡下觀察,以出現亮綠色熒光病灶判定為陽性。

1.4.5分離毒VP3基因RT-PCR鑒定。①引物的設計與合成。根據GenBank上已公布的vvIBDV VP3基因序列,用OLIGO 6.0軟件設計1對引物:Pl:5′-CAGCTTGCATGC CTGCAGG-3′;P2:5′-AACCTGATTACGAATTCGAGCT CG-3′,兩引物位于IBDV VP3基因首末端保守區,擴增產物約為1 041bp,由寶生物工程有限公司(大連)合成。②RNA提取。取250μL病毒液加入750μL Trizol RNA提取液,混勻,室溫放置15min。加入200μL氯仿,振蕩混勻,4℃ 12 000 rpm離心15min。取上清加入500μL異丙醇,室溫放置10 min,12 000rpm離心10min。棄上清,75%乙醇除鹽,倒置濾紙上吸掉剩余液體,干燥后懸于25μL的DEPC水中,備用。③cDNA合成。取8μL病毒RNA,加入上下游引物P1P2各1μL,100℃熱吸附10min,立即置于冰上10min,繼續加入5×first Standing Buffer 4μL、2.5Mm dNTPs 2μL、0.1mM DTT 2μL、M-MLV 1μL、Rnasin 1μL,37℃溫育2h,取出后置4℃保存備用。④PCR擴增。取制備好的cDNA 4μL作模板,加入上下游引物P1P2各1μL、2.5mM dNTPs 8μL、10×buffer 10μL、rTaq 1μL、滅菌水75μL,反應體系為100μL。在PCR擴增儀內進行擴增,擴增條件為:95℃預變性5min,94℃變性1min、52℃復性1min、72℃延伸2min,35個循環,72℃ 10min。結束后取PCR產物4μL,在1%瓊脂凝膠上電泳。

1.4.6擴增產物序列測定。應用膠回收試劑盒回收PCR產物,與pMD18-T載體連接后轉化E.coil JM109,篩選并經PCR鑒定陽性重組質粒,選取陽性重組質粒由大連寶生物工程有限公司測序。

1.5同源性比較

采用DNAStar軟件對分離毒擴增產物(VP3基因)與GenBank中的登錄IBDV不同毒株進行核苷酸序列比較,選取的毒株分別是:超強毒為SH95(AY134874)、OKYM(D49 706)、UK661(X92760),弱毒株為JD1(AF321055),經典毒株為52/70(D00869),變異株為GLS(M97346)。

2 結果與分析

2.1病毒分離

雞胚接種48～120h后陸續死亡,胚體充血,絨毛尿囊膜水腫增厚,尿囊液清亮。

2.2分離毒部分特性鑒定

2.2.1血凝試驗。IBDV-FJ不凝集雞和鴿子的紅細胞,無血凝性,排除了雞新城疫和禽流感。

2.2.2人工感染試驗。分離毒接種28日齡雛雞后72h,陸續出現精神不振、羽毛蓬松、接種后4d出現死亡,剖檢出現與臨床一致的病變,并回收到病毒。

2.2.3瓊脂擴散試驗。分離毒AGP抗原與抗IBDV陽性血清之間出現1條清晰的白色沉淀線,表明被檢抗原為IBDV。

2.2.4免疫熒光試驗。臨床采集和人工感染發病雞法氏囊的冰凍切片與IBDV單抗作用后,在熒光顯微鏡下均觀察到亮綠色熒光病斑。

2.2.5RT-PCR鑒定。對提取的病毒RNA進行RT-PCR,擴增得到包含VP3基因全長的特異性目的片段長度約1 041bp,在1%瓊脂糖凝膠電泳中分離毒PCR產物出現與IBDV陽性對照大小一致的條帶(如圖1)。

2.3VP3全基因序列同源性比較

利用DNAstar分析軟件進行序列拼接并經BLAST分析,結果分離毒的擴增產物長度為1 041bp,包含870bp 的VP3全基因序列,其A、T、G、C等4種堿基的比例分別為28.9%、14.9%、26.4%、29.8%,共編碼290個氨基酸。將IBDV-FJ VP3基因與GeneBank中已登錄IBDV不同毒株進行同源性比較,可見分離毒VP3基因與IBDV 3株超強毒(SH95、OKY M、UK661)和經典毒株(52/70)的核苷酸同源性分別為97.7%～98.2%和95.2%(見表1),初步表明該分離毒為IBDV超強毒株。

3結論與討論

(1)本研究從福建省某發病雞場中疑似傳染性法氏囊病的病雞中分離到1株IBDV毒株(IBDV-FJ),該分離毒無血凝性,在瓊脂擴散試驗中能與抗IBDV特異性血清出現1條清晰的白色沉淀線;人工感染28日齡雛雞出現與臨床一致的病變,并回收到病毒;應用針對IBDV VP3基因的特異性引物進行RT-PCR,能擴增到長度為1 041bp的特異性目的片段,包含870bp的VP3全基因序列;序列分析發現分離毒VP3基因與IBDV超強毒的核苷酸同源性為97.7%～98.2%,差異小于3%;而與經典毒株、變異株和弱毒株的同源性為94.9%～95.2%,差異大于4%。

(2)根據GeneBank中已登錄的IBDV不同毒株VP3基因氨基酸序列,分析并推測出超強毒株與其他毒力株(弱毒株、傳統毒株和變異株)之間在VP3蛋白氨基酸序列中段存在3個較保守位點(N23、Y116和E141)和3個潛在的變異位點[7](超強毒株為D29、V268和A283,其他毒力病毒株為H29、A268和T283)。本研究分離的IBDV-FJ株VP3氨基酸序列N端有1個位點(D29),C末端氨基酸有2個位點(V268、A283),具有超強毒特征。初步表明,IBDV-FJ株在VP3蛋白氨基酸序列上具超強毒的分子特征,而非傳統毒力毒株。這為福建省首次報道。

(3)vvIBDV除引起免疫抑制外,其主要特征是致病力明顯增強、致死率極高。vvIBDV的抗原性與經典IBDV疫苗株之間無差別,這種毒力變異株能夠突破高水平母源抗體,破壞常規疫苗的保護作用,不僅能造成體液免疫抑制,而且對細胞免疫也有一定的影響。分離毒株人工感染雛雞除引起經典毒株相同的病變之外,還引起感染雞的法氏囊呈“紫葡萄樣”外觀、脾臟腫大和胸腺萎縮等病變,與報道的超強毒株[8,9]引起的病變一致。

4參考文獻

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