分子標(biāo)記發(fā)展簡史

周宇爝

摘要比較詳細(xì)地介紹了分子標(biāo)記的概念、理論基礎(chǔ)和目前常用的分子標(biāo)記的的發(fā)展過程和技術(shù)特點。

關(guān)鍵詞分子標(biāo)記;概念;基本原理;特點

中圖分類號Q78文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0264-07

隨著人們對生命認(rèn)識的不斷加深以及遺傳學(xué)的不斷深入發(fā)展,越來越多的遺傳標(biāo)記被發(fā)現(xiàn),遺傳標(biāo)記的種類和數(shù)量越來越多。主要分為4種類型,即形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記。顯然,前3種標(biāo)記都是以基因表達(dá)的結(jié)果(表現(xiàn)型)為基礎(chǔ),是對基因的間接反映;而DNA分子標(biāo)記則是DNA水平遺傳變異的直接反映。與表型標(biāo)記相比,DNA分子標(biāo)記具有能對各發(fā)育時期的個體、各個組織、器官甚至細(xì)胞作檢測,既不受環(huán)境的影響,也不受基因表達(dá)與否的限制,數(shù)量豐富,遺傳穩(wěn)定,對生物體的影響表現(xiàn)“中性”以及操作簡便等特點。分子標(biāo)記的所有這些特性,奠定了它具有廣泛應(yīng)用性的基礎(chǔ)[1-2]。

1分子標(biāo)記的來源及定義

1.1分子標(biāo)記的來源

“標(biāo)記”一詞,根據(jù)漢語大詞典的解釋,是“便于識別的標(biāo)識或者記號”。隨著人們對生命本質(zhì)認(rèn)識的一步步加深,在人們研究DNA序列時發(fā)現(xiàn)了大量的非編碼序列,甚至占到了全序列的90%以上。這些非編碼序列具有特殊的一級結(jié)構(gòu),如串聯(lián)重復(fù)、回文結(jié)構(gòu)、Alu序列(反向重復(fù)序列)、CpG島等,并且全基因組分布[3]。隨著人類基因組計劃的人類基因組框架草圖的完成和一個個模式生物的全基因組測序,一個個新的DNA特異序列被發(fā)現(xiàn)并且在染色體上定位,整個基因組內(nèi)的標(biāo)記密度越來越高,并且大量的特異序列與不同的基因片段有著不同程度的連鎖,所有這些標(biāo)記構(gòu)成了人類研究探索各種生物基因組DNA的地圖與路標(biāo)。

1.2分子標(biāo)記的定義

廣義的分子標(biāo)記指可遺傳并可檢測的DNA序列或者蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶(不同基因位點編碼的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位點上不同的等位基因編碼的酶的不同形式)。狹義的分子標(biāo)記僅僅指DNA標(biāo)記,一般所稱的分子標(biāo)記即被界定在此范圍之內(nèi)[4]。這是因為在應(yīng)用上DNA標(biāo)記比蛋白質(zhì)標(biāo)記廣泛的多。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比DNA的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有幾十種,而構(gòu)成DNA的堿基只有4種,通過指數(shù)級的排列方式僅是其一級結(jié)構(gòu)的可能性就有數(shù)量級上的差異,且不計蛋白質(zhì)更加復(fù)雜的二級、三級、四級結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)域。并且到目前為止,蛋白質(zhì)的復(fù)制與合成遠(yuǎn)不及DNA復(fù)制技術(shù)成熟,可控性也不高。因此,蛋白質(zhì)標(biāo)記應(yīng)用遠(yuǎn)不如DNA標(biāo)記方便和廣泛。但從更嚴(yán)格的意義上講,蛋白質(zhì)標(biāo)記是研究生命現(xiàn)象更為精確的標(biāo)記,因為其更穩(wěn)定、多態(tài)性更高,每種蛋白質(zhì)都是唯一的(序列唯一、構(gòu)象唯一)。

1.3理想的分子標(biāo)記

理想的分子標(biāo)記必須達(dá)到以下要求:①具有高多態(tài)性;②共顯性遺傳,即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型;③能明確辨別等位基因;④遍布整個基因組;⑤除特殊位點的標(biāo)記外,要求分子標(biāo)記均勻分布于整個基因組;⑥選擇中性(即無基因多效性);⑦檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化);⑧開發(fā)成本和使用成本盡量低廉;⑨在實驗室內(nèi)和實驗空間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)[5]。

特別需要提出的是,所有的分子標(biāo)記都必須滿足和某個基因或者已知標(biāo)記緊密連鎖(連鎖程度越高越好)甚至共分離。

但是,目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均無法同時滿足以上所有要求。使用者可以根據(jù)自己的實驗?zāi)康暮鸵缶唧w選用某種標(biāo)記技術(shù)。

2目前常用分子標(biāo)記的基本原理

2.1限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)

限制性片斷長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性內(nèi)切酶處理不同生物個體的DNA所產(chǎn)生的分子片斷大小的差異。此技術(shù)基于生物個體的基因組的變異,是研究不同基因組間的差異的技術(shù),由Grod-zicker于1974年首先提出。其基本原理是:物種經(jīng)過長期的進(jìn)化,各個種屬甚至品種之間的同源DNA序列上的限制性內(nèi)切酶識別位點不同,或者由于突變、重組等原因引起限制性內(nèi)切酶位點上的核苷酸的變化。若引起DNA分子某一特定內(nèi)切酶識別位點序列內(nèi)發(fā)生變化,這樣該位點就不能被切開,使得DNA片段比親本長;若突變后形成新的酶切位點,則酶切后的片斷變短。這樣,通過電泳可以將大小不同的片斷區(qū)分開來。對于分子量較小的質(zhì)粒DNA就可直接觀察到DNA長度的差異,但對于核DNA而言,DNA片斷呈連續(xù)分布,無法辨別差異,需通過Southern雜交轉(zhuǎn)移至支持膜上,用單拷貝或低拷貝的DNA克隆作為探針與膜上的酶切片斷雜交,通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù),發(fā)生變異的材料顯示的帶就可能與親本的帶處于不同位置。檢測出與此標(biāo)記DNA相關(guān)的片段構(gòu)建出多態(tài)性圖譜,即為RFLP[5,6]。這種特定的限制性片斷與DNA探針的組合,便可以作為遺傳標(biāo)記。由于RFLP起源于DNA的變異,不受顯隱性關(guān)系、環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響,具有遺傳的專一性和穩(wěn)定性的特點,在數(shù)量上不受限制,可隨機(jī)選取足夠數(shù)量能代表整個基因組的RFLP標(biāo)記,而且每個標(biāo)記變異大,檢測方便。用于檢測RFLP的克隆探針可隨機(jī)選取,可以是使核糖體DNA、葉綠體DNA,也可以是總DNA。這樣就可以獲得能夠反映遺傳差異的大量多態(tài)性,為進(jìn)行資源分析、品種鑒定、物種進(jìn)化、基因定位、親緣關(guān)系和遺傳距離的分析,遺傳圖譜的構(gòu)建提供了有力的工具。并且RFLP是共顯性標(biāo)記,能夠區(qū)別出雜合體與純合體[7]。雖然RFLP具有結(jié)果穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好,特別適合建立連鎖圖等優(yōu)點,但也具有檢驗步驟多、周期長、成本高等缺點。并且RFLP對DNA多態(tài)性檢出的靈敏性不高,RFLP連鎖圖譜上還有很大的空間區(qū)(gap),甚至在使用同位素時可能對人有一定的傷害等等,這些都是需要進(jìn)一步完善的地方。

2.2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美國杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等領(lǐng)導(dǎo)的2個小組于20世紀(jì)90年代同時開發(fā)出來的一種新的DNA指紋技術(shù)。此技術(shù)是應(yīng)用一系列隨機(jī)引物擴(kuò)增并尋找多態(tài)性DNA片段的遺傳標(biāo)記技術(shù)。這一技術(shù)建立于PCR反應(yīng)基礎(chǔ)之上,以隨機(jī)的短脫氧核苷酸(通常為10個堿基)作為PCR引物,對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增而產(chǎn)生多態(tài)的DNA圖譜。擴(kuò)增產(chǎn)生的片段可通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分開,經(jīng)溴化乙錠染色或銀染色得到多態(tài)性的DNA圖譜后進(jìn)行多態(tài)性觀察。在基因組上,每個引物可以連續(xù)直接擴(kuò)增特定的DNA片段,對一個特定的基因型來講,這些擴(kuò)增的片段或片段的類型是唯一的。它的應(yīng)用是基于這樣的一個理論:對于同一模板DNA,用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜(模板基因組間可能具有同源性),也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶即可作為該模板的分子標(biāo)記[8,9]。事實上,不同基因組DNA總是有一定差異的,所以用RAPD即可進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講,在一定的擴(kuò)增條件下,擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對特定的引物,復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多。

RAPD所用的一系列引物的DNA序列雖然各不相同,但對于某一特定引物來說,它同基因組DNA序列有特定的互補區(qū)域。這些特定區(qū)域在基因組的分布如果符合PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件的話,即引物在模板上的2條鏈如果有互補位置并且與引物的3′端在200bp以內(nèi),就可以擴(kuò)增出這一片段。如果基因組在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)生插入、缺失或者替換即可導(dǎo)致這些特定的結(jié)合位置分布發(fā)生變化而使PCR產(chǎn)物發(fā)生增加、缺失或者分子量發(fā)生改變,通過對PCR產(chǎn)物的檢測,即可找出基因組DNA在這些區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性[10]。由于RAPD分析時所用的引物數(shù)量極大,并且引物序列隨機(jī),雖然對某一引物而言檢測的區(qū)域有限,但是利用一系列引物可以檢測的區(qū)域幾乎可以覆蓋整個基因組。與RFLP是從一系列酶切片段中尋找多態(tài)性片段不同,RAPD是利用PCR隨機(jī)合成多態(tài)性DNA片段,檢測被擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的遺傳特征變化。其具體優(yōu)點體現(xiàn)在:①極大的豐富性,能反映整個基因組的變化;②強(qiáng)大的可探測性,無需合成特定的引物;③高效性與靈敏性。短期內(nèi)可以得到大量的擴(kuò)增片段,只要是遺傳特異性的發(fā)生變化,即使親緣關(guān)系很近的個體也可以識別出[11]。

RAPD最大的特點是引物的堿基序列是隨機(jī)的,所用引物通常多達(dá)幾百種,并且1套引物可以用作多個物種或者群體,所以RAPD技術(shù)在用于遺傳多樣性和品種鑒定的研究中具有極大的優(yōu)越性。因此,用來鑒定品種純度是很有用的。據(jù)報道[9],從玉米、大豆、小麥及紅三葉草干種子中提取DNA并成功地利用RAPD技術(shù)擴(kuò)增DNA片段;中國科學(xué)院遺傳所陳洪等利用OPP-18引物成功地鑒定了雜交水稻汕優(yōu)63雜種純度,鑒定結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定完全一致。RAPD技術(shù)反應(yīng)靈敏、多態(tài)性強(qiáng),操作簡便,速度快,費用低,既有大量的隨機(jī)引物可供篩選之用,又不受種屬的限制,被廣泛用于多種作物的種子鑒定[9,11,12]。

由于是隨機(jī)引物對整個基因組進(jìn)行多態(tài)性檢測,在技術(shù)上簡單易行不需要克隆制備、同位素標(biāo)記、Southern印記等預(yù)備性工作,所需DNA樣品量少,安全性好,價格便宜,是繼RFLP之后應(yīng)用最廣的分子標(biāo)記。由于引物沒有特異性,1套引物可用于不同生物基因組的的分析,分析速度快,短期內(nèi)可得到大量的遺傳標(biāo)記,并克服了同工酶位點少和RFLP操作技術(shù)復(fù)雜的弊端,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳作圖、基因定位和克隆、物種進(jìn)化及鑒定特殊染色體區(qū)段的鑒別和分離以及動植物育種等方面,特別是在尋找與目的基因連鎖的分子標(biāo)記方面,近年來報道了大量的與各種目的基因連鎖的RAPD標(biāo)記。水稻的Xa-21 基因和西紅柿的pto基因的成功分離就是首先找到了與目的基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記,然后通過定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。

與PCR相比,RAPD具有以下特點:①RAPD使用的是隨機(jī)引物,不需要預(yù)先了解目的基因和相應(yīng)的序列;②操作簡便,實驗周期短,能在較短的時間篩選大量樣品;③引物具有普遍適應(yīng)性,適用于自動化操作分析。

與RFLP相比,RAPD具有以下特點:①RAPD分析只需要少量模板,1次擴(kuò)增僅需20~100ng,這對于DNA量很少的材料進(jìn)行基因組分析有利。比如對花粉粒、原生質(zhì)體、種子等的DNA分析是切實可行的。②RAPD標(biāo)記具有更大的隨機(jī)性,亦有利于圖譜的構(gòu)建。對于DNA含量大的和多倍體物種,RFLP探針會與多倍體的多個片段雜交,所得到的混合指紋會對其他等位基因的闡明帶來困難。而且由于DNA量較大,進(jìn)行單拷貝的Southern雜交不很實際,至少需要很長的曝光時間,并且已知的探針數(shù)量有限。RAPD大大增加了可構(gòu)建遺傳圖譜物種的數(shù)量。③無需借助于有傷害性的同位素,耗費的人力物力少。④靈敏度高。引物中的個別堿基的變化會引起擴(kuò)增條帶和強(qiáng)度的劇烈變化,這是RFLP所無法比擬的。短期內(nèi)可以得到大量的擴(kuò)增片段,只要是遺傳特異性發(fā)生變化,即使親緣關(guān)系很近的個體也可以識別出。⑤RAPD標(biāo)記可以覆蓋整個基因組,包括編碼和非編碼區(qū),可以反映整個基因組的變化。但是,由于引物的競爭性等,基因組的RAPD位點有時不能全部檢出,造成假象上的差異,這在種屬親緣關(guān)系的研究上尤其明顯。⑥RAPD產(chǎn)物有大于50%的條帶擴(kuò)增于單拷貝區(qū),經(jīng)過克隆和序列分析后,可作為RFLP和原位雜交的探針,在基因定位、克隆及輔助選擇育種中可以廣泛應(yīng)用。

隨著RAPD日益廣泛的使用,其不足之處也逐漸顯現(xiàn),比如標(biāo)記的顯隱性位點性,致使其不能在后代中區(qū)分雜合體和純合體;穩(wěn)定性差,由于是單鏈引物隨機(jī)的結(jié)合,在眾多的反向重復(fù)序列上,每次的實驗結(jié)果可能不一致。解決辦法是對單鏈引物進(jìn)行篩選,優(yōu)化PCR條件;高度的變異性,即使在親緣關(guān)系很近的物種間,結(jié)果也可能差異極大;Tm值低的隨機(jī)引物易受外界環(huán)境影響,如Mg2+濃度等[8,9,14]。

由于RAPD技術(shù)是由多種成分參加的生化反應(yīng),反應(yīng)中各種成分均為微量,盡管其反應(yīng)靈敏度高,但是影響因素較多,故而RAPD受環(huán)境影響很大,穩(wěn)定性差,重復(fù)性也不好,因此對實驗的設(shè)備、條件及其操作的一致性很嚴(yán)格,這又大大限制了它的使用。為了得到較穩(wěn)定的結(jié)果,各種反應(yīng)參數(shù)必須事先優(yōu)化選擇,操作中每一步都必須小心謹(jǐn)慎,以防止出現(xiàn)差錯。

2.3特征序列擴(kuò)增區(qū)域(Sequence-characterized amplified regions,SCAR)

RAPD標(biāo)記一般表現(xiàn)顯性遺傳,但若某RAPD片段不是重復(fù)序列,也可將其轉(zhuǎn)化為RFLP標(biāo)記。另外,為了提高某一理想RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性,可首先將其克隆并對其末端測序,之后,在原來RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸,以此為引物對基因組DNA再行擴(kuò)增分析,此即SCARs(Sequenced Characterized Amplified Regions)標(biāo)記[15]。

SCAR首先由Parar和Michlmore(1993)提出并應(yīng)用。SCAR標(biāo)記是在RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本步驟是:先作RAPD分析,然后把目標(biāo)RAPD片段(如與某目的基因連鎖的RAPD片段)進(jìn)行克隆和測序,根據(jù)原RAPD片段兩末端的序列設(shè)計特定引物(一般比RAPD引物長,通常24個堿基,是在原RAPD引物的3′與5′端延長14個堿基),利用兩端各24個堿基的引物再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增,這樣就可把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點鑒定出來。這樣的位點就稱為SCAR。總的來說,SCAR比RAPD和其他利用隨機(jī)引物的方法在基因定位和作圖中的應(yīng)用更好,因為它有更高的可重復(fù)性(原因是使用的引物長),標(biāo)記是共顯性遺傳的[16]。

該方法與RAPD相比,具體有如下優(yōu)點:①由于有較長的引物,退火溫度較高,因此具有更高的檢測穩(wěn)定性;②有將顯性RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性的SCAR標(biāo)記的可能性;③如果是顯性標(biāo)記,則在檢測中可以直接染色而不需電泳檢測。另外,用RAPD找到擴(kuò)增片段后不再設(shè)計引物,而是直接測序后通過電腦軟件分析(如用ClustalX軟件進(jìn)行對位,MEGA軟件計算DNA序列間的差異百分率和轉(zhuǎn)換/顛換數(shù),UPGMA軟件建親緣關(guān)系樹狀圖等),找出特異性的堿基作為鑒定的特異性標(biāo)記[17]。

2.4與RAPD技術(shù)相近的分子標(biāo)記種類

下面提到的所有技術(shù)都是利用1個或2個短的富含GC堿基的隨機(jī)引物。

(1)DNA擴(kuò)增指紋圖譜(DNA amplification fingerprint-ing,DAF)[18]。與RAPD技術(shù)不同的是,在DAF分析中,引物濃度更高,引物長度更短(一般5~8個堿基),只有2個溫度循環(huán)(在RAPD中是3個溫度循環(huán)),并且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳,DAF通常會產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型。

(2)任意引物PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR)。AP-PCR使用的引物較長(10~50個堿基),但PCR反應(yīng)前2個循環(huán)的嚴(yán)謹(jǐn)條件較低,最終的反應(yīng)結(jié)果與RAPD類似[19]。在AP-PCR分析中,擴(kuò)增分為3個部分,每個部分要求的條件和組分的濃度存在差異;在第1個PCR循環(huán)中,引物濃度較高;引物長度不定,并且常常來自為其他目的而設(shè)計的引物(如M13通用測序引物)。

2.5擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Poly-morphism),亦稱選擇性限制片段擴(kuò)增(SRFA, Selective Res-triction Fragment Amplification),是荷蘭Keygene公司的Za-beau Marc和Vos Pieter于1993年創(chuàng)建的一種新型的分子標(biāo)記,并于當(dāng)年獲得了歐洲專利局專利[20]。

它是RFLP和PCR相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù),既有RFLP的可靠性,又有PCR(如RAPD)的靈敏性,多態(tài)性高。其基本原理是利用PCR技術(shù)選擇性擴(kuò)增基因組DNA雙酶切后產(chǎn)生的限制性片斷。基因組經(jīng)2種限制性內(nèi)切酶消化以后將一雙鏈DNA人工接頭(artificial adapter)連接于限制性片斷兩端。然后根據(jù)接頭序列和限制性位點附近的區(qū)域的堿基序列,設(shè)計一系列3′端含數(shù)個隨機(jī)變化的選擇性堿基的PCR引物進(jìn)行特異性條件擴(kuò)增,只有那些限制性位點的側(cè)翼序列與引物3′端選擇堿基相匹配的限制性片段才能得以擴(kuò)增。這些選擇性堿基數(shù)目的多少主要是由待測樣品的基因組大小決定,選擇性堿基數(shù)目多,選擇性就強(qiáng),擴(kuò)增產(chǎn)物就少;反之,其數(shù)目就少,選擇性弱,擴(kuò)增產(chǎn)物就多。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離顯示其多態(tài)性。當(dāng)不同基因組DNA中因為突變引起限制性位點的數(shù)量發(fā)生改變或2個限制性位點之間的區(qū)域內(nèi)發(fā)生堿基插入、片段消失或順序重排時,電泳譜帶顯示多態(tài)性,多態(tài)性以擴(kuò)增片段的長短不同和數(shù)量多寡顯示出來[21]。

AFLP的技術(shù)特點包括以下幾個方面:①使用2種內(nèi)切酶消化模板DNA。一些酶的切割位點較多,如MseI、TaqI、XbaI等,另一些酶切位點較少,如PstI等等。采用雙酶切割的原因是:多切點酶產(chǎn)生小片段,便于凝膠分析切點數(shù)少的酶減少擴(kuò)增片段,由于AFLP反應(yīng)中擴(kuò)增片段是2個酶共同酶切的片段,這樣減少了選擇擴(kuò)增時所需的選擇堿基數(shù)。雙酶可以進(jìn)行單鏈標(biāo)記,從而防止電泳中因為雙鏈泳動不均而產(chǎn)生的雙帶假象。并且可使少量引物產(chǎn)生許多不同的引物組合,從而產(chǎn)生大量的不同的AFLP指紋圖譜[22]。另外,不同物種基因組的AFLP過程中使用的限制性內(nèi)切酶也不盡相同。EcoRI可靠廉價,是6堿基內(nèi)切酶的首選。分析真核生物基因組時大多使用MseI(4堿基),因為MseI的識別序列是TTAA,而真核生物基因組富含AT序列,與TaqI相比(其識別序列為TCGA),可以獲得更多的便于PCR擴(kuò)增和電泳分離的小片段DNA[23]。②AFLP的接頭為雙鏈寡核苷酸。人工合成時接頭未進(jìn)行磷酸化處理,所以只有1條單鏈連接于酶切片段的末端。③與常規(guī)的PCR相比,AFLP的引物有其獨特性。其引物有3部分構(gòu)成:與接頭互補的核心序列、內(nèi)切酶識別序列以及3′末端的選擇性堿基。該類引物的一個重要特征是通常以鳥苷酸G開頭,這樣可以有效的形成雙鏈,不過當(dāng)dNTP濃度過低時容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)。此外,選擇性堿基的數(shù)目影響著AFLP反應(yīng)的特異性。研究表明,引物帶有1~3個選擇性堿基時擴(kuò)增的選擇性較好。當(dāng)選擇性堿基超過4個時,擴(kuò)增的錯配程度超過了允許程度,故而AFLP的選擇性堿基數(shù)目一般不超過3個,具體數(shù)目取決于基因組的大小。研究表明,分析500Mbp以下的植物基因組時用EcoRI+2(2個選擇性堿基)/MseI+3引物組,500~6 000 Mbp的基因組應(yīng)采取EcoRI+3/MseI+3較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊锝M。微生物通常采用1個選擇性堿基的引物組[24]。④AFLP的PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。首先預(yù)擴(kuò)增,其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過一定比例稀釋后,以此為模板再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。兩步擴(kuò)增可以減少擴(kuò)增產(chǎn)物中的非特異性帶,降低了不清晰電泳造成的指紋圖譜的背景,提高了指紋圖譜的清晰度,還可以增加擴(kuò)增片段數(shù),為AFLP分析提供充足的模板。

AFLP技術(shù)不僅具有其他分子標(biāo)記的優(yōu)點,即位點數(shù)量無限,呈典型的孟德爾遺傳,無表型、復(fù)等位效應(yīng),不受環(huán)境影響等,還具有一些獨特的優(yōu)越性,如標(biāo)記異常豐富,典型的AFLP反應(yīng)中,1次電泳可得到100~150個擴(kuò)增產(chǎn)物,其他標(biāo)記技術(shù)難以達(dá)到。穩(wěn)定性、重復(fù)性好,應(yīng)用非常廣泛,可用于任何生物基因組的遺傳分析。與PCR技術(shù)結(jié)合,可在短時間內(nèi)得到大量多態(tài)性標(biāo)記。同時對模板濃度不敏感,模板需求量也小。Vos Pieter在對番茄基因組AFLP分析時,證實了模板濃度在相差1 000倍以內(nèi)(0.000 5~25ng)獲得的指紋圖譜基本一致。另外,在AFLP中標(biāo)記的引物會全部耗盡,引物耗盡后,擴(kuò)增的帶型不受循環(huán)數(shù)的影響。這樣模板濃度即使不一致也可以通過增減循環(huán)次數(shù)的方法獲得強(qiáng)度一致的帶型。目前,AFLP是構(gòu)建基因組特定區(qū)段高密度連鎖圖譜的最有效的方法。此外,AFLP全基因組分布非常適合構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。AFLP也可以用于檢測DNA庫(DNA pool)克隆的DNA大片段的多態(tài)性,而且其多態(tài)性的標(biāo)記大多對應(yīng)于基因組的某一位置,這樣就可以和STS一樣,成為遺傳圖譜(genetic map)和物理圖譜(physical map)之間的橋梁[25,26]。

實際操作中,影響AFLP指紋圖譜結(jié)果的因素很多。因此,應(yīng)采取質(zhì)量高、純度好、分子量大的的基因組DNA作為模板。如果模板中含有其他雜質(zhì)或者DNA降解很嚴(yán)重,導(dǎo)致酶切不完全,許多未經(jīng)酶切的模板片段經(jīng)電泳后產(chǎn)生表現(xiàn)為高分子量的條帶(假帶),導(dǎo)致不能真實地反映被測物種的多態(tài)性。為了避免電泳的條帶過多或者過少,應(yīng)對PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,篩選出最佳的引物組合。PCR擴(kuò)增時,應(yīng)在模板變性之前加入Tag酶和dNTP,否則會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。反應(yīng)體系中的dNTP濃度不能過低,否則擴(kuò)增產(chǎn)物容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)[21,27]。

2.6序列標(biāo)簽位點(STS)

序列標(biāo)簽位點(Sequence -Tagged Site,STS)指的是一段序列已知并且能夠在基因組中作為“路標(biāo)”使用的DNA序列,是對由特定引物序列所界定的一類DNA標(biāo)記的統(tǒng)稱。其最大特點就是利用特異PCR,因此結(jié)果非常可靠。顯然,成為STS必須滿足2個條件:①序列已知;②位置確定并唯一。從理論上講,任何一段DNA都可以成為STS。但是,由于需要的是與某一個目標(biāo)性狀基因或已知的標(biāo)記緊密連鎖的DNA片段,因此能夠利用的STS數(shù)量則非常有限。根據(jù)單拷貝的DNA片段兩端的序列設(shè)計1對特異引物擴(kuò)增基因組DNA,產(chǎn)生的一段長度為幾百bp的特異序列在基因組中往往只出現(xiàn)1次,從而能夠界定基因組的特異位點。在人類基因組作圖中已用其作為將遺傳圖譜與物理圖譜整合的共同位標(biāo),這在基因組作圖上具有非常重要的作用。隨著大量的模式生物的全基因組測序,會有越來越多的可利用的STS被發(fā)現(xiàn)。

2.6.1表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)記(Expressed Sequence Tags,EST)。EST是指一小段(通常長度300~500bp)單次重復(fù)的mRNA序列或cDNA序列。它們在特定的組織或者特定的時期內(nèi)特異的表達(dá),可以看作是特定的cDNA文庫中的標(biāo)記。EST計劃由美國科學(xué)家Venter于1989年提出,并首先應(yīng)用于人類基因組研究,之后被廣泛用于植物基因組研究,它是通過大規(guī)模的cDNA隨機(jī)測序,從而獲得對基因組認(rèn)識的一種研究策略。目前,許多國家和組織正在開展某些作物基因組EST計劃的研究,如成立于1998年的國際小麥族EST協(xié)作網(wǎng)(International Triteace EST corperation,ITEC),就是致力于麥類EST研究和開發(fā)的[28]。近幾年來,國際公共數(shù)據(jù)庫中的EST序列呈指數(shù)增長,截止到2006年8月,美國生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫Genbank已公布涉及205 000種生物的61 132 599條EST序列,總長度共65 369 091 950bp。

快速增長的ESTs數(shù)據(jù)為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了一個巨大的有價值的來源。首先,避免了傳統(tǒng)SSR標(biāo)記開發(fā)需要構(gòu)建基因組DNA文庫等煩瑣步驟,而且從ESTs中發(fā)掘出的SSR只是ESTs測序計劃的副產(chǎn)品,從而節(jié)省了大量人力物力[29];其次,其本身是功能基因的一部分序列,所以它將為功能基因提供“絕對”的標(biāo)記[30]。同時,由于不同物種間基因共線性和保守性,從一種作物中開發(fā)的EST-SSR可同時用于其他作物研究,從而能夠為比較基因組學(xué)和同源基因克隆提供新的途徑[31]。現(xiàn)在EST-SSR已被用于構(gòu)建遺傳圖譜、分離與鑒定新基因、基因表達(dá)差異研究、比較基因組研究和制備DNA芯片等方面。

另外,還有一種被稱為GSS序列的標(biāo)記。GSS序列本質(zhì)上和EST序列是一樣的,不同之處是它的序列直接來源于基因組而不是mRNA或cDNA。它通常有以下幾種來源:①全基因組檢測得到的特異/單次重復(fù)序列;②來自質(zhì)粒/BAC/YAC克隆所得到的單次重復(fù)序列;③基因組外顯子捕獲;④通過Alu—PCR得到的序列。

2.6.2微衛(wèi)星(SSR)。微衛(wèi)星(microsatellite)又叫做簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat)或者短串聯(lián)重復(fù)序列(Short trandem repeat,STR)、簡單序列長度多態(tài)性(Simple Seque-nce Length Polymorphism,SSLP)。簡單序列重復(fù)多態(tài)性(Si-mple Sequence Repeat Polymorphisms,SSRP)微衛(wèi)星指的是真核生物普遍存在的遍布整個基因組的排列為2~5個核苷酸的短串聯(lián)重復(fù)序列,如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等,尤以(CA)n重復(fù)序列最為常見,其長度由重復(fù)單位的拷貝數(shù)決定。在真核生物基因組中微衛(wèi)星很豐富,通常長度能夠達(dá)到150bp,是一類呈高度多態(tài)的遺傳標(biāo)記,不僅可用于基因組遺傳連鎖圖的構(gòu)建以及基因的定位與克隆,而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷。其重復(fù)單位數(shù)目的改變可以引起相當(dāng)高的多態(tài)性,但突變率僅為0.5×10-4~5.0×10-4,在家系中可以穩(wěn)定地遺傳,是一種很好的遺傳標(biāo)志[32]。

微衛(wèi)星約占真核基因組的5%,其基本構(gòu)成單位一般為1~8bp,多位于編碼區(qū)附近,也可位于內(nèi)含子、啟動子及Alu序列(反向重復(fù)序列)中。人類基因組約有5~10萬個(CA)n重復(fù)序列。通常認(rèn)為重復(fù)序列的產(chǎn)生是由于在遺傳物質(zhì)復(fù)制過程中DNA滑動或在有絲分裂、減數(shù)分裂期染色體不對等交換所致,因此該重復(fù)序列多存在于不經(jīng)嚴(yán)格選擇的基因組區(qū)域。目前普遍認(rèn)為微衛(wèi)星充當(dāng)基因重組的熱點是基因重排和變異的來源[33]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instabi-lity,MSI)是指由于復(fù)制錯誤(replication error,RER)引起的簡單重復(fù)序列的增加或丟失,也稱RER陽性或RER表型。MSI首先在結(jié)直腸癌中觀察到。微衛(wèi)星通過改變DNA結(jié)構(gòu)或通過與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮其基因調(diào)控作用。

由于微衛(wèi)星的寡核苷酸在同一物種的不同基因型之間差異很大,可以利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物根據(jù)與微衛(wèi)星重復(fù)序列兩翼的特定保守序列設(shè)計,用來擴(kuò)增重復(fù)序列本身。由于重復(fù)的長度變化極大,所以這是檢測多態(tài)性的1種有效方法[34]。其特點包括:一般檢測到的是1個單一的多等位基因位點;共顯性遺傳,故可鑒別雜合子和純合子;得到的結(jié)果復(fù)性很高。為了提高分辨力,通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳,它可檢測出單拷貝差異。也可以在同1個反應(yīng)試管中把PCR反應(yīng)與不同的SSR引物結(jié)合起來(稱為multiplexing),這可節(jié)省時間,但是,這只能在不同引物的產(chǎn)物在大小上下不重疊的情況下才能使用[35,36]。很顯然,使用SSR技術(shù)的前提是需要知道重復(fù)序列兩翼的DNA序列的信息,這一方面可以在其他種的DNA數(shù)據(jù)庫中查詢,否則就必須先建立含有微衛(wèi)星的基因組文庫,再從中篩選可用的克隆,進(jìn)行測序,然后設(shè)計合適的引物。同時,這種由保守序列確定的微衛(wèi)星序列也具有染色體位點的特異性,因此1981年Miesfeld等首次發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星后,很快成為1種常用高效的分子標(biāo)記。統(tǒng)計分析表明,不同的物種其微衛(wèi)星的突變頻率也是穩(wěn)定的。SSR的PCR引物也是對某一高變重復(fù)位點高度專一的。用特定引物擴(kuò)增出相應(yīng)的微衛(wèi)星片段后,再通過電泳分離,差異可經(jīng)過EB或者銀染后觀察。一般種群可顯示出超過10種類型的等位基因。微衛(wèi)星不僅重復(fù)單位變異數(shù)大,而且其重復(fù)區(qū)域總長度又在PCR易于擴(kuò)增的區(qū)域,快速簡便,所需的DNA用量小。與等位酶相似,微衛(wèi)星是具有獨立的共顯性基因。由于微衛(wèi)星的遺傳中性并且比等位酶法有更多的可供檢測的等位基因,這樣就可以提供更加精細(xì)的基因變化的范圍,因此在種群研究上有著更大的應(yīng)用[3,34,37-39]。

簡而言之,微衛(wèi)星的最大優(yōu)點在于通過簡單的PCR擴(kuò)增即可直接檢測到已知的特定的染色體位點,不僅具有一般PCR操作簡單、快速、成本低的特點,還具有RFLP的穩(wěn)定可靠、特異性、共顯性等特點,不足之處是其引物開發(fā)難度較大,技術(shù)復(fù)雜,周期長,成本也高。不過隨著眾多模式生物的全基因組測序的飛速進(jìn)展,對全基因組了解的日益全面,各個大型數(shù)據(jù)庫的逐步完善,并且借助越來越發(fā)達(dá)的計算機(jī)計算和預(yù)測技術(shù),使得開發(fā)成本有所降低。

2.6.3其他具有特定引物的分子標(biāo)記種類。

(1)加錨微衛(wèi)星寡核苷酸(Anchored microsatellite oli-gonucleotides)。Zietki-ewicz et al(1994)對SSR技術(shù)進(jìn)行了發(fā)展[40],他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物,對基因組節(jié)段而不是重復(fù)序列本身進(jìn)行擴(kuò)增。在SSR的5′端或3′端加上2~4個隨機(jī)選擇的核苷酸,這可引起特定位點退火。這樣就能導(dǎo)致位于反向排列的間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這類標(biāo)記又被稱為ISSR(inter-simple sequence repeat)、ASSR(anchored simple sequence repeats)或AMP-PCR。這類標(biāo)記往往是顯性遺傳的。在所用的兩翼引物中,可以1個是ASSR引物,另1個是隨機(jī)引物。如果1個是5′端加錨的ASSR引物,另1個是隨機(jī)引物,則被稱為RAMP技術(shù)。

(2)CAPS(Clea-ved amplified polymorphic sequence)。CAPS技術(shù)又可稱為PCR-RFLP。所用的PCR引物是針對特定的位點而設(shè)計的。其基本步驟是:先進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切,再用瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分開,用EB染色,觀察。與RFLP技術(shù)一樣,CAPS技術(shù)檢測的多態(tài)性其實是酶切片段大小的差異。在酶切前進(jìn)行RCR產(chǎn)物檢測,其多態(tài)性稱為ALP。Neff et al.(1998)在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出dCAPS技術(shù)(derived CAPS),這是檢測單核苷酸多態(tài)性的一種良好方法。

(3)單引物擴(kuò)增反應(yīng)(single primer amplification reaction,SPAR)。SPAR技術(shù)與RAPD技術(shù)相似的是也只用1個引物,但SPAR分析中所用的引物不是隨機(jī)的,而是在SSR的基礎(chǔ)上設(shè)計的,例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。擴(kuò)增的是SSR之間的DNA序列。又稱為MP-PCR(microsate-llite-primed PCR)。

(4)小衛(wèi)星區(qū)域DNA直接擴(kuò)增(directed amplification of minisatellite region DNA,DAMD)。直接用小衛(wèi)星的核心序列作引物進(jìn)行擴(kuò)增。

(5)Inter-Alu PCR like genomic profiling。與SPAR技術(shù)相近,也只用1個引物,但所用的引物是在Alu序列(反向重復(fù)序列)的基礎(chǔ)上設(shè)計的,擴(kuò)增的是copia(另一種反向重復(fù)序列)序列之間的DNA序列。

(6)ISTR(inverse sequence-tagged repeat)。這種技術(shù)與SPAR技術(shù)也相近,所用的引物是在copia序列的基礎(chǔ)上設(shè)計的,擴(kuò)增的是copia序列之間的DNA序列。

(7)IFLP(intron fragment length polymorphism)。檢測的對象是內(nèi)含子的長度差異。根據(jù)內(nèi)含子兩端的特征序列設(shè)計引物,擴(kuò)增出長度不同的內(nèi)含子片段。

(8)RAMPO(random amplified microsatellite polymorph-ism)。RAMPO的英文全名與RAMP的英文全名相近,但實驗方法卻不同。RAMPO的基本步驟是:先用1個單一的隨機(jī)引物(即RAPD引物)對基因組DNA擴(kuò)增,用電泳將擴(kuò)增片段分開,然后,把凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,使之與一個帶有放射性標(biāo)記(或其他標(biāo)記)的與SSR互補的寡核苷酸探針如(CA)8和(GA)8雜交,放射自顯影后可得到新的多態(tài)性類型。

先找到RFLP標(biāo)記后,對RFLP探針進(jìn)行測序,再合成適當(dāng)?shù)腜CR引物,這樣可發(fā)現(xiàn)新的STS標(biāo)記。這也可稱為RFLP-PCR。

3抗性基因同源序列(RGA)

近年來,在各種農(nóng)作物抗性育種的進(jìn)程和模式生物的抗性研究中,在水稻、玉米、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥等植物中克隆了若干抗性基因,包括植物對病毒、細(xì)菌、線蟲的抗性基因。例如煙草抗花葉病毒基因、水稻抗白葉枯病基因Xa-21、擬南芥抗丁香假單胞桿菌基因RPS2、亞麻抗銹病基因L6以及甘蔗抗胞囊線蟲基因HS1等。

Leister等通過分析研究已克隆的植物抗病基因的結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年,《美國科學(xué)院院刊》在同一期發(fā)表了2篇應(yīng)用同源序列從大豆中克隆R基因同源序列的報道,從而引發(fā)了同源序列法在植物抗病基因研究中的應(yīng)用。隨后的大量研究表明,植物抗病基因中存在多種類型的保守結(jié)構(gòu)域。Hammond Kosack和Parker通過分析已克隆的植物抗病基因結(jié)構(gòu),將植物抗病基因分為8 類,其中,含有NBS-LRR(富亮氨酸重復(fù)子Leucine-rich Repeats,LRR)結(jié)構(gòu)域的抗病基因是最主要的類型。

這些結(jié)構(gòu)可能是參與蛋白質(zhì)之間的相互作用或者細(xì)胞信號的傳導(dǎo)以及識別。根據(jù)抗性基因的這一共性,以其保守結(jié)構(gòu)的序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物,在任何作物中,用PCR技術(shù)擴(kuò)增和分離具有相似序列的DNA片段,即抗性基因同源序列。

RGA提供了一種快速鑒定候選抗性基因的便捷途徑。目前已經(jīng)利用此技術(shù)在小麥、大豆、馬鈴薯中鑒定了候選抗性基因,它們在基因組的位置基本上就在已知的抗病基因區(qū)域。已知基因包括抗病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲的基因。而且部分與抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此,應(yīng)用RGA進(jìn)行基因定位可以較快地檢測到與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。可以預(yù)見,RGA將成為抗性基因定位的重要手段,并且在分子作圖的領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更加巨大的作用[41,42]。

4單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)

單核苷酸多態(tài)性是指2套基因組的DNA序列兩兩進(jìn)行位置比對時, 單個核苷酸的的不同而顯示出的差異(多態(tài)性)。因此,SNP反映了過去多數(shù)突變事件的特點,2個個體在同一位點攜帶的不同等位基因被認(rèn)為是進(jìn)化的遺傳標(biāo)志。顯而易見,SNP是目前已知的多態(tài)性最高的分子標(biāo)記。據(jù)Genbank估計,如果比較2套人類基因組的DNA序列,出現(xiàn)SNP的頻率可達(dá)1/2 000~1/1 000,看起來這個頻率并不高,但是考慮到人類基因組共有3.2×109bp時,即可能出現(xiàn)3.2×1012個SNP位點時,這個數(shù)量已經(jīng)相當(dāng)可觀了。并且這只是2套基因組之間的比較,所有的SNP位點肯定比這個數(shù)字大得多。水稻中SNP分布頻率也很高,平均1 000bp就有1個SNP,這些標(biāo)記隨著水稻基因組的實施而被發(fā)現(xiàn)和利用。由于SNP具有同一個位點多態(tài)性低而全基因組多態(tài)性又極其豐富的特點,并且分析時只需要進(jìn)行陰/陽性分析而不需進(jìn)行片段的長度分析,特別適合用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的掃描分析,是繼微衛(wèi)星后最為高效的標(biāo)記。不過其昂貴的成本(開發(fā)和使用的成本都很高)使其應(yīng)用受到一定的限制。建立可供利用的SNP標(biāo)記需經(jīng)過以下幾步:①全基因組測序;②根據(jù)測序結(jié)果確定特定的序列標(biāo)記位點;③對STS進(jìn)行掃描,尋找SNP位點;④確定SNP;⑤將SNP定位到染色體上。

5單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformational Poly-morphism,SSCP)

SSCP是指DNA單鏈構(gòu)象的多態(tài)性,是基于PCR擴(kuò)增而新發(fā)展起來的一項檢測DNA多態(tài)性的分析技術(shù)。在進(jìn)行SSCP分析時,利用PCR特異的擴(kuò)增出基因組目的DNA片段,然后將這些擴(kuò)增出來的DNA片段進(jìn)行變性處理,使雙鏈DNA分開成單鏈,再用非變性凝膠電泳分離。由于在自然狀態(tài)下,單鏈DNA會折疊卷曲,形成一定點空間構(gòu)象,這種空間構(gòu)象是由DNA鏈的堿基序列決定。如果擴(kuò)增的目的DNA片段序列的堿基發(fā)生了變異,就可能造成其單鏈的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而影響其單鏈電泳時的遷移速率,導(dǎo)致其在電泳圖譜上的帶紋位置不同,顯示出不同生物個體DNA的特異性。

6新型分子標(biāo)記的開發(fā)及其應(yīng)用前景

自從20世紀(jì)70年代第1代分子(RFLP)標(biāo)記出現(xiàn)以來,分子標(biāo)記家族迅速發(fā)展繁榮起來,并且準(zhǔn)確性和靈敏性也一步步提高。目前的SNP技術(shù)已經(jīng)可以在單個核苷酸的水平上找出不同樣本之間的差異,即使它們之間的親緣關(guān)系非常接近。

縱觀分子標(biāo)記的發(fā)展,是伴隨著人們對生命本質(zhì)的認(rèn)識一步步加深,認(rèn)識范圍從宏觀表型一步步逼近微觀世界的進(jìn)程同步發(fā)展的。任何一個特殊生命現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),都可能導(dǎo)致革命性的理論或技術(shù)的產(chǎn)生,DNA雙螺旋理論的提出導(dǎo)致了DNA的自我復(fù)制理論,又進(jìn)而導(dǎo)致了PCR技術(shù)以至于后來的全自動PCR儀的問世(當(dāng)然也少不了其間Taq聚合酶的發(fā)現(xiàn))。比如各種類型的外切酶和內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了RFLP技術(shù)的產(chǎn)生。

重大的技術(shù)突破來源于理論的突破性進(jìn)展,重大理論的提出來源于無數(shù)細(xì)微現(xiàn)象的總結(jié)。回顧20世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破:1900年孟德爾的遺傳理論被重新認(rèn)識;1920年,摩爾根的基因理論和連鎖遺傳的提出;1953年,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論的提出;直到90年代,自動PCR儀的出現(xiàn)。從此,人們又進(jìn)入了一個眾多實驗現(xiàn)象的重復(fù)和積累的階段。已經(jīng)有很多不能解釋甚至是矛盾的試驗現(xiàn)象在陸續(xù)出現(xiàn)。可以預(yù)言,下一次的理論突破將導(dǎo)致更加革命性的發(fā)現(xiàn),也必將使得分子標(biāo)記技術(shù)能夠從更加深的層面上解釋生命現(xiàn)象本身,人們對分子標(biāo)記的認(rèn)識和利用也更加深刻和簡便。并且隨著計算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展,使得人們不僅能從浩如煙海的數(shù)據(jù)和現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)總結(jié)規(guī)律,還能夠根據(jù)現(xiàn)有的現(xiàn)象和規(guī)律來預(yù)測可能的現(xiàn)象乃至規(guī)律。根據(jù)目前的發(fā)展來看,分子標(biāo)記的用途不會再局限在傳統(tǒng)的生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域,還會擴(kuò)大到諸如數(shù)據(jù)加密傳輸、計算技術(shù)等領(lǐng)域。

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