羅非魚血液和肌肉中土霉素萃取方法的研究

王偉利　段建偉　羅　理　姜　蘭　鄒為民

摘要通過HPLC方法對土霉素對照品進樣分析，繪制了土霉素的標準曲線，線性方程為y=355 00 x+238，檢測限為0.002 5μg/mL，定量限為0.005μg/mL，在0.005~10.000μg/mL之間線性關系良好，相關系數R=1.000 0。使用乙酸乙酯和不同體積高氯酸萃取，發現：使用乙酸乙酯萃取效率略低于5%高氯酸，但因為沸點低易于濃縮的優勢，在滿足試驗要求的前提下可以考慮使用乙酸乙酯萃?。粚τ谘汉图∪庵型撩顾氐妮腿?，考慮時間和試劑消耗，10mL的5%高氯酸1次萃取即可滿足一般檢測需求。

關鍵詞土霉素；回收率；變異系數；固相萃取

中圖分類號X836文獻標識碼A文章編號1007-5739（2009）07-0203-02

土霉素是四環素類藥物，作用機制是通過與核糖體30s亞基的特異性結合，抑制肽鏈延長和蛋白質合成；抗菌譜廣，對革蘭氏陽性和陰性細菌均有抑制作用。近年來，由于耐藥性嚴重，已經減少了其在生產、臨床上的使用。由于土霉素在可食性產品中的殘留會對骨骼和牙齒產生不可逆的色素沉著等不良影響。因此，控制土霉素的使用，實施對動物性食品中土霉素及有害代謝產物殘留的檢測十分重要。世界糧農組織、世界衛生組織、歐盟及我國政府對魚肉中土霉素的殘留都做出了嚴格的規定，其殘留限量不得高于0.1mg/kg。

有關土霉素的藥代動力學方面的研究已經見有很多報道，多數通過0.5%~5.0%高氯酸萃取和固相萃取小柱進行凈化處理，但是由于高氯酸難以濃縮，使用固相萃取小柱凈化、有機溶劑洗脫，雖然易于濃縮，但成本較高。

本試驗以羅非魚為研究對象，通過比較乙酸乙酯和高氯酸對土霉素的萃取效果、不同劑量高氯酸萃取回收率、高氯酸對組織中土霉素的回收率及固相萃取中不同溶劑洗脫雜質的回收效果等，以期對于水產動物組織中土霉素萃取方法的選擇提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1儀器。Water 2695高效液相色譜儀、2487紫外檢測器，SUPELCO VISIPREP 24TM DL固相萃取儀，美國Orga-nomation N-EVAPTM 112氮吹濃縮儀，德國IKA T18勻漿機，SIGMA 3K158離心機，瑞士METTLER TOLEDO的pH計和分析天平，太倉市科教器材廠VORTEX SHAKER WH-861型振蕩器。

1.1.2試劑。土霉素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號130487-200302，含量88.2%）；乙腈、甲醇、正己烷均為HPLC級；乙二胺四乙酸二鈉為超級純，MBCHEM公司產品；硝酸、乙酸乙酯、高氯酸、磷酸二氫鈉等均為分析純；Waters OASIS HLB 3cc/60mg固相萃取柱；試驗用羅非魚由珠江水產研究所基地提供。

1.1.3試劑的配制。土霉素儲備液：稱取土霉素對照品0.01g溶于100mL、pH值2.5、0.01moL的NaH2PO4，4℃保存，1個月內有效；5%乙二胺四乙酸二鈉溶液：取5g的EDTA-2Na用蒸餾水定容至100mL；0.01moL的NaH2PO4：稱取1.56g的 NaH2PO4·2H2O溶于蒸餾水中，定容至1 000mL，以硝酸調節pH值至2.5，0.45μm濾膜過濾后備用。

1.2試驗方法

1.2.1液相色譜條件。根據水產品中土霉素殘留量的測定SC/T 3015-2002標準，略有調整；色譜柱：Waters Atlantis C18，5μm，4.6mm×150mm Column；檢測器：Waters 2487紫外檢測器；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL；流動相：乙腈-0.01moL磷酸二氫鈉溶液=26-74。

1.2.2標準曲線的繪制。將土霉素對照品儲備液稀釋至10 μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.002 5 μg/mL，按上述色譜條件進樣檢測。

1.2.3樣品準備。試驗用羅非魚10條（平均體重200±10g），經檢測血液和肌肉中不含土霉素。采集血液使用0.1%的肝素鈉抗凝，準確定量均分至1mL/份；背部兩側肌肉去磷片、去皮，準確定量均分至1g/份。

1.2.4乙酸乙酯與高氯酸萃取回收率比較。取血液2份，分別加入1μg/mL土霉素對照品，回旋振蕩器振蕩5min；分別用1mL的5%高氯酸和1mL乙酸乙酯萃取，方法如下：勻漿30s；振蕩3min；5 000rpm 離心5min；取上清液0.45μm濾膜過濾后上樣檢測。

1.2.5不同劑量萃取劑回收率比較。分別取血液和肌肉各4份，血液和肌肉各取1份作為空白對照，其余分別加入土霉素1μg；用5%高氯酸1mL、10mL和10mL（2次）萃取回收檢測。

1.2.6固相萃取不同溶劑洗脫雜質回收效果比較。取血液2份，分別添加1μg、0.1μg的土霉素，使用10mL的5%高氯酸萃取，Waters Oasis HLB固相萃取小柱凈化。洗脫雜質程序中，分別采用5%甲醇水和ddH2O洗脫，計算相對回收率。固相萃取程序如下：①依次用3mL甲醇、2mL的5%EDTA-2 Na、3mL的ddH2O平衡萃取柱；②萃取液過柱；③用5mL的5%甲醇水洗脫雜質或者ddH2O洗脫雜質；④負壓下抽干2min；⑤5mL甲醇洗脫樣品；⑥氮吹儀40℃水浴吹干，pH值2.5的0.01moL的NaH2PO4定容至1mL；⑦振蕩器振蕩1min，液相檢測。

2結果與分析

2.1標準曲線與回歸方程

土霉素標準工作液在0.005~10.000μg/mL之間線性關系良好，檢測限達0.002 5μg/mL，定量限為0.005μg/mL，線性方程為y=35 500x+238，線性相關系數R=1.000 0（見圖1）。

2.2乙酸乙酯與5%高氯酸萃取效果比較

乙酸乙酯和高氯酸的回收率分別為50.3%、58.3%。高氯酸萃取回收率較乙酸乙酯高；乙酸乙酯萃取雜質較多，但均與土霉素峰形分離完全。由于乙酸乙酯沸點低（77.2℃），容易濃縮，故在滿足檢測要求的前提下，為了節約樣品濃縮處理時間，乙酸乙酯仍是個較好的選擇（見圖2）。

2.35%高氯酸不同劑量萃取效果比較

在增大萃取劑用量的情況下，萃取效率明顯提高，但是1∶10之后，繼續增大萃取劑用量，回收率提高不大。在試驗要求允許的情況下，為了節約試劑、時間及濃縮的方便，1∶10萃取較好（見表1）。

2.4固相萃取不同溶劑洗脫雜質回收效果比較

5%的甲醇水洗脫雜質回收率明顯低于ddH2O效果，表明5%甲醇水會洗脫少量被分析物土霉素；同時隨著樣品中土霉素含量的提高，洗脫的比例也增加（見表2）。

3討論

（1）乙酸乙酯為低沸點的有機溶劑，常用于血液等組織中痕量物質的回收處理。相對于常用的高氯酸和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液萃取方法，乙酸乙酯具有回收率接近，易于濃縮的優勢。

（2）國標SC/T 3015-2002方法中，5%高氯酸萃取后，使用正己烷去除樣品中的脂質。本試驗過程中經過比較，發現對于血液等脂肪含量少的組織，不進行除脂步驟不影響后期檢測。

（3）土霉素的固相萃取方法多使用C18或HLB固相萃取小柱進行，均達到較好效果，其中HLB小柱的回收率及穩定性優于C18。在凈化過程中，文獻中多使用5%甲醇水或ddH2O洗脫雜質，其中Waters HLB推薦用法為5%甲醇水。本研究使用Waters HLB小柱凈化回收，發現使用ddH2O洗脫雜質對土霉素的回收率在高中低（10μg、1μg、0.1μg）3個濃度加標量土霉素的回收率均在90%左右，高濃度回收率更達98.1%，明顯高于5%甲醇水洗脫雜質。

4參考文獻

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