如何利用發光細菌檢驗水中有毒有害物質

劉　輝

摘要：水源污染引發了一系列的問題，首先是水質檢驗，特別是水中有毒有害物質的檢驗問題，水中有毒有害物質可以通過各種水質分析方法予以檢出，然后對之進行對人體健康的綜合評價，檢測水中有毒有害物，有時采用生物方法，如魚毒理學生物檢驗，水蚤試驗等；也有采用近代遺傳毒理學的方法，如Ames致突變試驗[1]，姐妹染色體交換試驗等等，則可提供水質對人體健康影響的信息，本文則介紹利用發光細菌檢驗水中有毒有害物質的基本原理，檢驗方法和評價標準。

關鍵詞：水質檢驗；發光細菌；有毒有害物質

1發光細菌的存在、分離、純化和培養[2]

廣闊的海洋是發光細菌生活的大本營，從近海沿岸到南北極；從海水表面到深達1000米的海底都可找到發光細菌，只有少數生活在淡水湖泊河流中；有的寄生于各種海洋動物如海魚的發光器官中；有的獨立生活在海水中，其數量依外界條件的變化而異，據測定夏秋季的海水中每毫升多達幾十到幾百個，發光細菌屬于腸道菌屬，分為十個種四個屬，在我國海洋中也陸續分離到十個種的六種，其中包括我國特有的新種。

發光細菌可以直接從海水中和海魚的體表和內臟中分離，所采用的培養基為：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCI3%，瓊脂2%，pH6.5。高壓滅菌后制成平板，將海魚或無脊椎動物（如烏賊）切成3～4cm大小小塊，或取其內臟放入滅菌培養皿中20℃培養12－18小時，在暗室中尋發光點，用接種環挑取發光點，在營養平板上，線培養后形成單個發光菌，再挑取單菌落反復劃線分離幾次，即可得到純化的發光菌株，將純化的菌株接種入同樣成分的斜面培養基上，經培養12小時后，在4℃下保存，每月轉接一次，可長期保存活力，使用前接種到液體培養基中20℃下振蕩培養10－12小時，用磷酸緩沖液稀釋后備用。

國內外一般都用明亮發光桿菌(Photobacterium Phospholcum)作有毒有害物的檢驗，上海華東師范大學已將此菌種制成干燥粉劑-20℃下可長期保存，使用極為方便。

2發光菌的發光機理

微生物在氧化代謝或呼吸作用過程中得到能量，呼吸作用等于生物的氧化作用，好氣性細菌具有細胞色素氧化還原酶系統，由于好氣性細菌的細胞色素可以作為氫的最終受體而利用空氣中的氧，底物的氫傳遞到NAD（煙酰胺腺嘌呤核苷酸）的脫氫酶的輔基上，結果形成還原型的AAD-H2，它可以將氫傳遞給黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，后者轉化為FAD-H2，就可以傳遞給細胞色素，能量以ATP（三磷酸腺苷）的形式釋放。

發光細菌的發光過程是一種光呼吸過程，是上述電子傳遞鏈上的一個側支[2]，還原型的黃素單核苷酸，FMNH2充當反應的底物，螢光酶起催化作用，長鏈脂肪醛起作改變螢光酶構造的“修飾”作用。螢光酶通過分子氧催化FMNH2和脂肪醛(RCHO)的氧化，這種氧化還原反應結果便產生磷光(465～490nm之間較多)。外界條件和培養基成分pH，溫度，氧濃度變化會影響細菌的發光，而有毒的化學物質，重金屬離子，抗生素，化學治療劑，農藥等同樣會影響細菌發光，故采用發光細菌作為敏感的指標物測定有毒有害物是可能的。

3發光細菌檢測有毒有害的方法[3]

儀器：SHG-1型生物化學發光測量儀（上海市技術監督局實驗工廠產品）或Microtox 2055型毒物分析系統（美國MICROBICS CORPORATION產品）

培養基。液體培養基：酵母膏5g，胰蛋白胨5g，NaCI40g，Na2HPO45g，KH2PO4lg，甘油3g，蒸餾水1000ml，pH6.5。

固體培養基：上述液體培養基成份加2%瓊脂即可。

稀釋用磷酸緩沖液：Na2HPO45g，KH2PO4lg，

NaCI30g，蒸餾水100ml，pH6.5。

水樣濃縮。作某化學物質的試驗只需配制一定濃度的溶液即可，進行水樣中有毒有害物質的試驗則需事先進行水樣中毒害物的吸附，洗脫和濃縮。

取一定體積水樣V升（視水質而定），用大孔樹脂(XAD系列事先分別經甲醇、乙腈、丙酮回流8小時后保存于甲醇中)，用重蒸乙醚洗脫，濃縮至殘渣，用1ml重蒸過的二甲亞砜溶解之。

1ml≈1V升水樣0.1ml≈0.1V升水樣

4 測定步驟

4.1 菌體活化：裝置為0.5ml干燥菌劑，開封后注入2～3ml冷的稀釋液，在旋轉混合器上振蕩2～3分鐘，20℃平衡5～10分鐘，使其活化，待發光穩定后即為活化菌懸浮液，置4℃下備用（活化后一天可用）。

菌液處理：吸取不同體積（視水質而定）二甲亞砜水樣濃縮液，分別在試管中用無菌蒸餾水稀至1ml，加入1ml緩沖液，然后再加入0.1ml菌懸浮液，搖勻，在一定溫度下(20±1℃)反應10分鐘。

并同時以二甲亞砜作對照試驗。

用SAG-1型發光測量儀測定光強度。

活菌計數。在測定光強度的同時用上述加有菌懸浮液的稀釋液稀釋涂布營養平板，23℃培養12～16小時，計算活菌數。

結果計算：相對抑光率=對照管光強－樣品管光強／對照管光強×100％

細菌死亡率=對照活菌數－樣品組活菌數／對照組合菌數×100％

對于單一化學物質當達到抑光率為50%時的濃度用EC50表示，目前已有大量的有機物測得了其EC50值[4]。

對于水樣試驗結果只能用水樣體積表示，EV50即表示抑光率為50%時所相對應的水樣體積。

5 試驗結果的評價標準

對于某個水樣品可根據EC50評價其毒性的有無，按照25%的準則，當某個水樣品的EC50 25%時可記為有毒，按50%準則，某個水樣的EC50≤50%可記為有毒[5]，還有一些其它分級方法。如何用發光細菌的檢驗結果來評價水質進行分類是一個有待研究的問題，目前只能用以在相同條件下比較不同水樣的毒性，即加入同一水樣體積后測定其抑光率，抑光率大小評價其毒性；或者測得其EV50，依EV50的大小評價其毒性。

參考文獻

[1]岳舜琳：“給水環境毒理學簡介”《上海城鎮供水》1988年1期14-17頁。

[2]吳自榮：觀察生物發光現象的好材料--發光細菌《生物學通報》1986年第6期。

[3]吳自榮等“以發光細菌作指示生物快速評價塑料包裝材料的生物毒性”《中國環境監測》1987年3卷第4期。

[4]KLAUS L.E.KAISER;Photobacterium pho phoreum Toxicity Bioassay 11,Toxicity Data CompilationToxicity Assesmint:An International Journal Vo1.3 195-237(1988)。

[5]A.A.Bulich;A Practical and Reliable Mlthod for Monitoring the Toxicity of Aqualic SampltsMar ch/April 1982 P.45-47。

作者簡介：劉輝：1989年至今在鹽山水務局工作。現任河北省鹽山縣水務局化驗室主任，助理工程師。多年來一直從事水質化驗與水資源開發利用研究工作。于1996年9月在北京農民大學進修。