環毛蚓纖溶酶的分離純化及ｐＨ值對其活性的影響

王洋洋

摘要以鹽城地區分布廣泛的新鮮環毛蚓為原料。經過4℃抽提、分段鹽析、SephadexG-100凝膠柱層析、PEG-6000濃縮以及制備電泳等步驟分離純化蚯蚓纖溶酶。在聚丙烯酰銨凝膠電泳和纖維平板活性檢測的基礎上，選用割膠的方式，最終得到蚯蚓纖溶酶的一種單一組分。該酶具有較強的溶解纖維蛋白的作用，SDS-PAGE測得其分子量為20KD。不同pH對其纖溶活性影響不同。采用單因素方差分析和多重比較，結果表明DH為8.0-12.0環境下該纖溶酶活性均較大。其中pH為9.0～12.0相互之間差異不顯著，pH為9.0與8.0差異極顯著，pH為10.0與8.0差異顯著。

關鍵詞環毛蚓蚯蚓纖溶酶分離純化

中圖分類號0-33文獻標識碼B

血栓栓塞性疾病如腦血栓、冠心病已成為當今危及人類生命的常見多發病。因此，尋找有效的治療藥物是國內外醫藥學界重點攻關內容之一。鏈激酶、尿激酶及組織型纖溶酶原激活物(t－PA)的問世使這類疾病得以治療。但是近年來由于艾滋病對人類的危害日益加深，新的溶栓、抗栓藥物亟待研究。自1983年，日本宮崎醫科大學美原恒教授首先從蚯蚓體內分離出纖溶酶，并以此為原料制成的溶栓藥物以其服用方便、副作用小、藥理作用廣而廣泛應用于臨床。國內許多單位相繼研究報道了部分蚯蚓纖溶酶的分離純化及性質方面的研究工作，但是關于鹽城地區環毛蚓纖溶酶的研究還未見報道。由于蚯蚓來源不同，蚯蚓個體的蛋白質種類和含量也不同。我國蚯蚓品種有300種左右，其中13種用作中藥。環毛蚓屬毛足綱、巨蚓科、環毛屬。本實驗著重探討該酶的分離純化方法，并在此基礎上利用單因素方差分析和Duncan比較方法研究pH值對其活性的影響。

1材料和方法

1，1材料和試劑

蚯蚓為環毛蚓，在龍岡中學校園內挖掘；法布萊士凍干人纖維蛋白原、凝血酶、SephadexG-100、尿激酶、其他試劑均為國產分析純。

1，2儀器

冷凍高速離心機；凝膠柱層析系統；電泳儀；蛋白檢測儀。

1，3方法

1，3，1蚯蚓纖溶酶粗液的制備

新鮮蚯蚓洗凈，吐泥2 d，再洗凈、濾紙吸干水份稱重。置于預冷小燒杯內快速剪成組織糜狀后迅速勻漿。加入等體積pH為8.0，0.02 mol／L的磷酸緩沖液在4攝氏度下浸提過夜，離心(8 000 r／min，30 min)，取上清液密封備用。

1，3，2蚯蚓纖溶酶的分離純化

鹽析曲線的制作：取一定量的蚯蚓纖溶酶粗品，分7次加入硫酸銨至不同飽和度，單獨收集每次沉淀。沉淀充分溶解于PBS中，測定其蛋白含量。

分段鹽析：向粗酶液中逐量加入研磨細的硫酸銨固體至20％飽和度，同上離心取上清；再加硫酸銨至60％飽和度，同上離心取沉淀。

透析除鹽：以蒸餾水為透析液，用10％BaCl₂檢測SO當不再出現白色沉淀時更換透析液為PBS，至沉淀量不再減少時停止透析。

凝膠過濾層析：選取SephadexG-100灌制層析柱(2.5 cmx50 cm)，經PBS平衡后，取樣品液上柱，同樣的緩沖液洗脫，收集有活性的洗脫液。

濃縮：PEG-6000濃縮洗脫液。

電泳制備及活性印記試驗：按照Laemmli方法進行，垂直電泳槽制作不連續電泳系統：12％分離膠，5％濃縮膠。將上述濃縮液加樣2孔電泳結束后切開凝膠，一半用于測定纖溶活性，一半用于染色對照。同樣的方法電泳后，從凝膠上切下目的條帶搗碎并用PBS充分洗脫蛋白。

1，3，3 SDS-PAGE

按照Weberk方法進行。

1，3，4蚯蚓纖溶酶的活力測定

按照Astrup方法制備纖維蛋白平板。各樣品加樣5 uL，37攝氏度保溫2 h，測定溶圈兩相互垂直直徑作乘積，以尿激酶為標準計算酶活力。

1，3，5蛋白濃度測定

采用考馬司亮藍法。

1，3，6 pH對酶纖溶活性影響

樣品液與pH為1-14的緩沖液充分混合，37℃放置2 h。測定、計算酶活力。對活性較大的pH做重復試驗，并在此基礎上進行單因素方差分析和Duneun比較。

2結果與分析

2，1硫酸銨鹽析曲線圖

纖維蛋白檢測結果表明30％－60％飽和度沉淀溶解物有纖溶活性，低于20％和大于60％飽和度的沉淀溶解物無活性(圖1)。

2，2 Sephadex

G-100凝膠柱層析圖譜：洗脫曲線呈現3個峰。其中峰Ⅲ無纖溶活性，峰I和峰Ⅱ具有纖溶活性，且峰Ⅱ活性高于峰I(圖2)。

2，3 PAGE和印記試驗

洗脫樣品液濃縮液進行及活性檢測，結果如圖3所示，聚丙烯酰銨凝膠電泳條帶中對應有三個條帶有溶栓活性。

2，4蚯蚓纖溶酶純化各步酶比活力變化

隨著純化倍數的逐漸增加，總蛋白含量呈下降趨勢，但酶的比活力依次增大(表1)。

2，5 SDS-PAGE測定結果

采取割膠的方式將有活性的三個條帶割下，分別用PBS洗脫。洗脫液濃縮后經SDS-PAGE得到一電泳純物質，其分子量為20 KD。

2，6不同pH對酶活力影響

pH為1-3、13-14條件下溶圈內有白色沉淀出現，可能該酶因強酸或強堿作用而變性；pH為5－7之間酶纖溶活性隨pH升高而逐漸增強；pH為8-12作用下纖溶活性均較強。對pH為8-12做5組重復實驗，單因素方差分析結果表明：pH為8.0，pH為9.0，pH為10.0，pH為11.0，pH為12.0對蚯蚓纖溶酶活性影響差異顯著(表2、表3、表4)。

3討論

環毛蚓組織經過一系列分離純化步驟得到纖溶酶的單一組分，纖維蛋白平板法活力檢測表明該組分能溶解纖維蛋白，且纖溶活性較強。因此它的開發研究無疑將擴大蚯蚓的應用范圍；將在生化、醫藥等領域具有重要的理論和應用意義；也很可能給鹽城地區乃至更大、更多區域帶來可觀的經濟效益。不同pH作用結果表明該酶的穩定范圍是pH為5.0-12.0，其中pH為8.0－12.0下效果較優。所以在pH為0.9～1.5的胃酸環境中，鹽城環毛蚓纖溶酶將會因變性而失去藥效。因此，以該酶為原料的膠囊或口服劑不能制成胃溶型。結合最近研究成果：蚯蚓纖溶酶可直接由腸上皮吸收，是一種“穿腸而過的生物大分子”，說明該酶可制成腸溶型溶栓、抗栓藥物。