環(huán)毛蚓纖溶酶的分離純化及ｐＨ值對(duì)其活性的影響

王洋洋

摘要以鹽城地區(qū)分布廣泛的新鮮環(huán)毛蚓為原料。經(jīng)過4℃抽提、分段鹽析、SephadexG-100凝膠柱層析、PEG-6000濃縮以及制備電泳等步驟分離純化蚯蚓纖溶酶。在聚丙烯酰銨凝膠電泳和纖維平板活性檢測(cè)的基礎(chǔ)上，選用割膠的方式，最終得到蚯蚓纖溶酶的一種單一組分。該酶具有較強(qiáng)的溶解纖維蛋白的作用，SDS-PAGE測(cè)得其分子量為20KD。不同pH對(duì)其纖溶活性影響不同。采用單因素方差分析和多重比較，結(jié)果表明DH為8.0-12.0環(huán)境下該纖溶酶活性均較大。其中pH為9.0～12.0相互之間差異不顯著，pH為9.0與8.0差異極顯著，pH為10.0與8.0差異顯著。

關(guān)鍵詞環(huán)毛蚓蚯蚓纖溶酶分離純化

中圖分類號(hào)0-33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B

血栓栓塞性疾病如腦血栓、冠心病已成為當(dāng)今危及人類生命的常見多發(fā)病。因此，尋找有效的治療藥物是國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界重點(diǎn)攻關(guān)內(nèi)容之一。鏈激酶、尿激酶及組織型纖溶酶原激活物(t－PA)的問世使這類疾病得以治療。但是近年來由于艾滋病對(duì)人類的危害日益加深，新的溶栓、抗栓藥物亟待研究。自1983年，日本宮崎醫(yī)科大學(xué)美原恒教授首先從蚯蚓體內(nèi)分離出纖溶酶，并以此為原料制成的溶栓藥物以其服用方便、副作用小、藥理作用廣而廣泛應(yīng)用于臨床。國(guó)內(nèi)許多單位相繼研究報(bào)道了部分蚯蚓纖溶酶的分離純化及性質(zhì)方面的研究工作，但是關(guān)于鹽城地區(qū)環(huán)毛蚓纖溶酶的研究還未見報(bào)道。由于蚯蚓來源不同，蚯蚓個(gè)體的蛋白質(zhì)種類和含量也不同。我國(guó)蚯蚓品種有300種左右，其中13種用作中藥。環(huán)毛蚓屬毛足綱、巨蚓科、環(huán)毛屬。本實(shí)驗(yàn)著重探討該酶的分離純化方法，并在此基礎(chǔ)上利用單因素方差分析和Duncan比較方法研究pH值對(duì)其活性的影響。

1材料和方法

1，1材料和試劑

蚯蚓為環(huán)毛蚓，在龍岡中學(xué)校園內(nèi)挖掘；法布萊士?jī)龈扇死w維蛋白原、凝血酶、SephadexG-100、尿激酶、其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1，2儀器

冷凍高速離心機(jī)；凝膠柱層析系統(tǒng)；電泳儀；蛋白檢測(cè)儀。

1，3方法

1，3，1蚯蚓纖溶酶粗液的制備

新鮮蚯蚓洗凈，吐泥2 d，再洗凈、濾紙吸干水份稱重。置于預(yù)冷小燒杯內(nèi)快速剪成組織糜狀后迅速勻漿。加入等體積pH為8.0，0.02 mol／L的磷酸緩沖液在4攝氏度下浸提過夜，離心(8 000 r／min，30 min)，取上清液密封備用。

1，3，2蚯蚓纖溶酶的分離純化

鹽析曲線的制作：取一定量的蚯蚓纖溶酶粗品，分7次加入硫酸銨至不同飽和度，單獨(dú)收集每次沉淀。沉淀充分溶解于PBS中，測(cè)定其蛋白含量。

分段鹽析：向粗酶液中逐量加入研磨細(xì)的硫酸銨固體至20％飽和度，同上離心取上清；再加硫酸銨至60％飽和度，同上離心取沉淀。

透析除鹽：以蒸餾水為透析液，用10％BaCl₂檢測(cè)SO當(dāng)不再出現(xiàn)白色沉淀時(shí)更換透析液為PBS，至沉淀量不再減少時(shí)停止透析。

凝膠過濾層析：選取SephadexG-100灌制層析柱(2.5 cmx50 cm)，經(jīng)PBS平衡后，取樣品液上柱，同樣的緩沖液洗脫，收集有活性的洗脫液。

濃縮：PEG-6000濃縮洗脫液。

電泳制備及活性印記試驗(yàn)：按照Laemmli方法進(jìn)行，垂直電泳槽制作不連續(xù)電泳系統(tǒng)：12％分離膠，5％濃縮膠。將上述濃縮液加樣2孔電泳結(jié)束后切開凝膠，一半用于測(cè)定纖溶活性，一半用于染色對(duì)照。同樣的方法電泳后，從凝膠上切下目的條帶搗碎并用PBS充分洗脫蛋白。

1，3，3 SDS-PAGE

按照Weberk方法進(jìn)行。

1，3，4蚯蚓纖溶酶的活力測(cè)定

按照Astrup方法制備纖維蛋白平板。各樣品加樣5 uL，37攝氏度保溫2 h，測(cè)定溶圈兩相互垂直直徑作乘積，以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算酶活力。

1，3，5蛋白濃度測(cè)定

采用考馬司亮藍(lán)法。

1，3，6 pH對(duì)酶纖溶活性影響

樣品液與pH為1-14的緩沖液充分混合，37℃放置2 h。測(cè)定、計(jì)算酶活力。對(duì)活性較大的pH做重復(fù)試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素方差分析和Duneun比較。

2結(jié)果與分析

2，1硫酸銨鹽析曲線圖

纖維蛋白檢測(cè)結(jié)果表明30％－60％飽和度沉淀溶解物有纖溶活性，低于20％和大于60％飽和度的沉淀溶解物無活性(圖1)。

2，2 Sephadex

G-100凝膠柱層析圖譜：洗脫曲線呈現(xiàn)3個(gè)峰。其中峰Ⅲ無纖溶活性，峰I和峰Ⅱ具有纖溶活性，且峰Ⅱ活性高于峰I(圖2)。

2，3 PAGE和印記試驗(yàn)

洗脫樣品液濃縮液進(jìn)行及活性檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，聚丙烯酰銨凝膠電泳條帶中對(duì)應(yīng)有三個(gè)條帶有溶栓活性。

2，4蚯蚓纖溶酶純化各步酶比活力變化

隨著純化倍數(shù)的逐漸增加，總蛋白含量呈下降趨勢(shì)，但酶的比活力依次增大(表1)。

2，5 SDS-PAGE測(cè)定結(jié)果

采取割膠的方式將有活性的三個(gè)條帶割下，分別用PBS洗脫。洗脫液濃縮后經(jīng)SDS-PAGE得到一電泳純物質(zhì)，其分子量為20 KD。

2，6不同pH對(duì)酶活力影響

pH為1-3、13-14條件下溶圈內(nèi)有白色沉淀出現(xiàn)，可能該酶因強(qiáng)酸或強(qiáng)堿作用而變性；pH為5－7之間酶纖溶活性隨pH升高而逐漸增強(qiáng)；pH為8-12作用下纖溶活性均較強(qiáng)。對(duì)pH為8-12做5組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，單因素方差分析結(jié)果表明：pH為8.0，pH為9.0，pH為10.0，pH為11.0，pH為12.0對(duì)蚯蚓纖溶酶活性影響差異顯著(表2、表3、表4)。

3討論

環(huán)毛蚓組織經(jīng)過一系列分離純化步驟得到纖溶酶的單一組分，纖維蛋白平板法活力檢測(cè)表明該組分能溶解纖維蛋白，且纖溶活性較強(qiáng)。因此它的開發(fā)研究無疑將擴(kuò)大蚯蚓的應(yīng)用范圍；將在生化、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的理論和應(yīng)用意義；也很可能給鹽城地區(qū)乃至更大、更多區(qū)域帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。不同pH作用結(jié)果表明該酶的穩(wěn)定范圍是pH為5.0-12.0，其中pH為8.0－12.0下效果較優(yōu)。所以在pH為0.9～1.5的胃酸環(huán)境中，鹽城環(huán)毛蚓纖溶酶將會(huì)因變性而失去藥效。因此，以該酶為原料的膠囊或口服劑不能制成胃溶型。結(jié)合最近研究成果：蚯蚓纖溶酶可直接由腸上皮吸收，是一種“穿腸而過的生物大分子”，說明該酶可制成腸溶型溶栓、抗栓藥物。