不同培養條件對泗棉三號莖尖培養的影響

朱　姝

摘要以陸地棉“泗棉3號”為材料，研究了活性炭、植物凝膠和組培苗的嫁接對其莖尖培養的影響。結果表明：在凝固劑植物凝膠上生長的莖尖狀況優于瓊脂；活性炭顯著地促進了莖尖成苗；嫁接顯著提高了組培苗的成活率，優化了泗棉三號的莖尖培養體系。

關鍵詞泗棉3號莖尖植物凝膠

棉花是重要的經濟作物，我國是世界上的主要產棉國家之一。隨著我國棉花育種工作的進步，培育出來了很多適合我國栽培的品種，自二十世紀七十年代以來，以基因工程方法培育棉花新品種，如Bt抗蟲棉花的培育品種，同時還結合生理育種、雜交育種等方式獲得很多優良品種。

莖尖培養在種質資源保存、特異材料擴繁和雜種優勢固定中起著十分重要的作用。利用這優點，可以建立莖尖分生組織和遺傳轉化結合的轉化體系。棉花莖尖分生組織由分生能力很強的細胞組成，快速生長，能夠長成完整植株。利用莖尖外植體作為轉基因受體，可以避免用原生質體、愈傷組織等作基因受體時所遇到的植株再生頻率低，再生植株后代易發生變異等障礙。

泗棉3號是江蘇泗陽棉花原種場育出來的，具有高產、優質、抗病等優良特性。本文以此為材料，研究了活性炭、植物凝膠和組培苗的嫁接對其莖尖培養的影響，為泗棉3號的遺傳改良，種質資源離體保存等提供技術參考。

1材料與方法

1.1實驗材料

泗棉三號種子，購自江蘇農科院明天種業公司。

泗棉3號是江蘇省泗陽棉花原種場采用抗病棉品系新洋76-75作母本與優質高產品系泗陽791作父本進行配組雜交選擇而育成的高產、優質、抗病棉花品種。1993年通過江蘇省農作物品種審定并定名。1994年通過省農作物品種審定委員會審定。1995年被國家科委列入“國家級科技成果重點推廣計劃”，農業部列入“發展棉花生產專項基金項目”。1996年被國家科委和農業部聯合評定為全國“八五”期間育成的10個重大農作物新品種之一，同年獲得江蘇省利技進步一等獎，1997年獲國家科技成果轉化一等獎。

泗棉3號植株高度中等，一般100厘米左右，株型疏朗呈塔形。葉片中等偏小，葉色偏淡，折褶明顯，向光性強。葉片空間排列合理，層次清晰，冠層結構好，節間勻稱，消光系數小，中下部葉層受光條件好，花蕾外露，通透性好。莖桿茸毛較多。果樹上舉，彈性較好，有效受光面積大，群體光能利用率高。鈴型卵圓形，中等大小，鈴殼薄，吐絮暢。

泗棉3號出苗較好，棉苗長勢強，對肥水反應彈性較大，生殖生長勢強，現蕾開花早，第一果枝生節位較低，開花、成鈴、吐絮集中，結鈴性強，衣分高，成熟早，霜前花率高。

泗棉3號豐產性突出。自育成以來，在省內外試驗及大面積示范種植，均表現出良好的豐產性能，一般畝產80-100公斤，高產田塊達125公斤以上。大面積豐產方，皮棉單產達150公斤。1994年在江西省都昌縣萬戶鄉唐美村種植2.6畝泗棉3號高產田，單產皮棉達204公斤，創長江流域皮棉單產量最高紀錄。

泗棉3號纖維品質優。江蘇省區試，纖維斷長22.97千米，顯著優于泗棉2號(21.09千米)，黃河流域區試鑒定：比強度20.9－麥克隆值4.6，達到國家“八五”攻關目標。

泗棉3號抗病蟲性強。經中國棉花所植保室、陜西省棉花所、河北省植保所兩年鑒定結果，平均枯萎病發病率為6.4％，病指為1.75，達高抗標準?？姑掴徬x性：經中國農科院植保所在地1993年抗性鑒定，泗棉3號蕾鈴受害率僅8.8％，比美國抗棉鈴蟲對照品種“HG-BR-8”(蕾鈴受害率15.32％)減退46.81％，抗性達I級高抗標準?？寡料x性：1996年經中國棉花所植保室鑒定，泗棉3號蚜害率對比照“非洲E40”(高抗)減退50.90％，達中抗標準。

泗棉3號適應性廣。自育成以來，在省內各地種植均表現出較大的增產幅度。在江蘇、安徽、江西、浙江、河南、湖南、湖北、山東、四川等省的不同棉區種植，均具有良好的適應性，并得以大面積推廣應用。曾年推廣面積連續兩年超過1000萬畝，是九十年代以來我國新育成的推廣面積最大的棉花品種。至2000年累計超過5000萬畝，新增社會經濟效益逾50億元。

泗棉3號是江蘇省1982年以來皮棉產量首次超過泗棉2號的棉花高產品種，打破了泗棉2號皮棉產量在江蘇省及長江流域區試中連年獨占鰲頭的局面。同時還將江蘇省及長江流域抗病棉的產量水平提高到一個新的高度，改變了長期存在的高產品種不抗病或抗病品種不高產的現象，實現了棉花品種高產、抗病、抗蟲兼優質相統一的目標，為我國棉花生產的發展作出了貢獻。

1.2方法

1.2.1種子處理

一般棉花種子處理有八種方法：

1.2.1.1曬種曬種可殺死病菌，增強抗病能力打破棉種休眠，提高發芽率，并可提早出苗1～2天。曬種一般多在播種前20天左右進行。方法：選擇晴天將精選好的棉種攤到蘆席或土場上(攤放厚度3～5厘米)曝曬4～5天，每天翻動3～5次，曬至用手搖響即可。

1.2.1.2溫湯浸種溫湯浸種可殺死附著在種子外和潛伏在種子內部的病菌并起到催芽作用，同時兼有剔除未成熟種子和殺滅種子上害蟲(主要是棉紅鈴蟲)等作用。方法：將“三開一涼”60～65℃的溫開水倒入缸內，放入曬選好的棉種(水和種子的比例是，攪拌均勻，浸悶30分鐘后撈出晾至種毛微白即可催芽或拌藥播種。為了保證缸內棉種上下受溫一致，浸悶過程中隔1G鐘要上下攪拌一次。溫湯浸種催芽稍晾后，按浸種前3份干棉種加1份3％的呋喃丹微粒劑拌勻后再進行播種，將有效地控制苗期蚜蟲危害。

1.2.1.3多菌靈膠懸劑浸種此法浸種對棉花炭疽病、立枯病防治效果好，對防治棉花枯、黃萎病也有一定作用。方法：40％多菌靈膠懸劑0～7公斤，兌水100公斤浸種50公斤，浸泡14小時后撈出播種。

1.2.1.4硫酸脫絨+“402”溫湯浸種此法可有效地防止枯、黃萎病發生和苗期病害，特別是外地引進的種子經此法處理后，其滅菌效果可達100％。

本實驗采用硫酸脫絨法處理種子。選用硫酸脫絨后的種子，用75％的酒精洗1min，無菌水沖洗2～3次，再用20％的過氧化氫浸泡2h，然后無菌水沖洗3～4次，再放入充足的無菌水在28℃下泡24h，待露白后，換水在同樣條件下泡24h。除去種皮，將種仁接種到只含1／2MS無機鹽的固體培養基上，在黑暗、28℃條件下培養到子葉長出，再見光培養1～2d。

1.2.2活性炭對莖尖的培養的影響將切好的莖尖轉到下面幾種濃度的活性炭(0.5g／L，10g／L，2.0g／L)的培養基中培養。在光照條件下培養，每天見光14h，光強均2000LX左右，培養溫度

25±2℃，大概20天左右，統計生長情況確定哪種活性炭濃度吸收次生代謝產物效果更好，更加有利于莖尖培養成再生植株。

1.2.3瓊脂和植物凝膠(Phytagel)對莖尖的培養的影響

傳統的凝固劑都是用瓊脂(8g／L)作為凝固劑，這里用sigma公司生產的植物凝膠(2.2g／L)做一個對比實驗，培養條件同1.2.2，大概20天左右，統計生長情況確定哪種作為凝固劑更加有利于莖尖培養成再生植株。

1.2.4嫁接對植株成活的影響

試管苗移植于室外，常常先使試管苗生根，然后移栽于花盆。但棉花的試管苗成活率低，而且此步驟共約2個月，耗時較長。如果將試管苗嫁接于自然條件下的砧木上，不僅節省時間，而且避免與土壤(常常是蛭石)的直接接觸而減少污染，提高移植的成活率。

2結果與分析

2.1不同濃度梯度的活性炭對莖尖再生的影響

活性炭能夠吸收外植體切口滲出的酚類物質。三種濃度的活性炭中，濃度0.5g／L的活性炭處理下沒有明顯的促進作用，苗發育狀態不好，與濃度1.0g／L處理下的苗存在一定的差異，濃度1.0g／L、2.0g／L處理下的莖尖發育的比較好，節間伸長情況良好，葉片比較綠，基本無褐化現象，株型和正常苗相似。可見其吸收次生代謝產物的效果最好。由于濃度2.0g／L的培養基比較影響對根的觀察，而且1.0g／L已經達到了很好的效果，所以確定該組織培養中吸收次生代謝產物的最佳活性炭濃度是1.0g／L。

2.2不同凝固劑對莖尖再生的影響

實驗結果表明，以植物凝膠為凝固劑的培養基中植株再生情況良好，生長速度明顯陜于瓊脂培養基上，基本只需要15天左右就能成苗，葉片長勢很好，莖節發育良好，褐化現象不明顯，因此以后就以此為凝固劑，不僅縮短了實驗周期而且提高了實驗效果，同時我們可以看出在不加活性炭的條件下，用植物凝膠作為凝固劑，植株的褐化程度明顯降低。所以植物凝膠可以取代瓊脂作為該組織培養的凝固劑。

2.3嫁接對成苗的影響

嫁接對再生植株的根系沒有特殊要求，無根苗、褐根苗和一些畸形苗以及組織培養過程中產生的變異苗等均可用于嫁接。實驗中削去砧木頂端，將嫁接苗對接，用塑料袋或地膜罩蓋保濕。7d后解除石蠟膜和細繩，即可看到砧木和接穗已通過愈傷組織緊密地連結在一起，新的葉也已開始生長。

本實驗嫁接成活率不是特別高，一般嫁接成活率可達到95％以上，嫁接時砧木與切口吻合不好，棉花苗齡過大，木質化，一些操作不規范等都會影響嫁接的成活率。

3討論

泗棉3號，具有農藝性狀優良的特點，是長江中下游的主要推廣品種，本實驗以此為材料，研究了多種物質對其莖尖培養的影響。由于其次生代謝產物對莖尖再生的抑制，為了去除這些次生代謝物選擇活性炭作為吸附劑，選擇幾個適宜的濃度，試驗出最適合泗棉3號莖尖生長的濃度為0.1g／L。加入活性炭以后生長在培養基上的莖尖生長很好，根部沒有發生褐化現象。

本實驗采用了植株凝膠作為凝固劑，并且發現其處理下的莖尖不僅發育良好，而且周期很短，相比與瓊脂作為凝固劑培養的周期大大縮短了，這樣可以縮短組織培養的進程，同而且植物凝膠在實驗的操作中還有更多的便利：瓊脂里雜質較多，滅菌后可能會出現抑制物質。

由于直接煉苗移栽等定植方法成活率較低，緩苗時間較長，棉花屬于木本植物，用此方法更困難。而嫁接能夠極大地提高再生植株的定植成活率，更能縮短緩苗時間，為基因工程乃至其他生物技術能夠順利地應用于棉花遺傳改良奠定了基礎。