鵝細小病毒延邊株VP3基因原核表達質粒構建

摘要:本試驗根據GenBank已公布的鵝細小病毒B株基因序列，設計了一對擴增VP3基因的特異性引物，對鵝細小病毒延邊分離株基因組DNA進行了PCR擴增，得到了約為1500bp的VP3基因片段，將其回收純化后與pMD-18T simple載體連接，然后進行克隆，經雙酶切分析、PCR鑒定及測序，驗證了所克隆的基因是鵝細小病毒VP3基因。用EcoR I和XhoⅠ雙酶切該片段并回收該片段，將此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-1原核表達載體中，獲得重組質粒PGEM-VP3，經PCR鑒定，限制性內切酶雙酶切分析，證實了重組質粒的正確性。

關鍵詞:鵝細小病毒;VP3基因;原核表達

Abstract: Specific primers for VP3 amplicafion

was designed according to the publiced goose parvovirus strain B gene sequence in GenBank.The genome DNA was amplified by PCR， which amplified a fragment about 1500 bp.It was purified and connected with pMD-18T simple vector and then transformed to E.coli BL21 competent cells for cloning， cutting by two-enzyme，then PCR and sequencing to identify.The result showed that the cloning gene is the goose parvovirus VP3， then got the fragment and prokaryotic expressionby vector by EcoR Iand BamH I digestion .And obtained recombinant plasmid PGEM-VP3 by linking prokaryotic expressionby vecto r PGEM-4T-1，and identified by PCR、double restriction enzyme analysis and sequence analysis，the result showed that it’s true.

Key words:gosling plague virus; VP3 gene; prokaryotic

前言

鵝細小病毒病俗稱為小鵝瘟，是由鵝細小病毒引起的主要侵害4-20日齡雛鵝和雛番鴨的一種高度接觸性和敗血性傳染病[1，2] 。由于該病病程短，傳播速度快，死亡率高，是目前危害養鵝業健康發展的最重要的傳染病之一，造成了相當大的經濟損失。從而引起了國內外學者的高度重視[3，4]。其中VP3是該病毒的主要衣殼蛋白和重要保護性抗原，且可以誘導機體產生免疫反應[5-7]。本研究利用原核表達載體PGEM-4T-1，構建鵝細小病毒VP3基因原核表達質粒，目的在于將體外表達的基因作為免疫原，為研制鵝細小病毒VP3基因亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒與菌種

GPV為本實驗室從延邊某養鵝場發生小鵝瘟的病死鵝脾臟中分離的病毒。將該病毒液用生理鹽水適當稀釋后，尿囊腔接種于12-14日鵝胚，收集72-120h內死亡的鵝胚尿囊液，4℃，5000r/min離心30min，取上清，-20℃保存備用。感受態菌BL21由本實驗室保存并提供。

1.1.2主要試劑

限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、蛋白酶K、IPTG、X-gal、酵母提取物、胰蛋白胨、Amp、Marker(DL2 000、DL1 5000)、DNA凝膠回收試劑盒、ExTaq、rTaq均購自寶生物(大連)生物工程公司。SDS、Tris飽和酚和低熔點瓊脂糖購自上海生物工程技術服務有限公司。原核表達載體PGEM-4T-1由本實驗室保存并提供。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成

根據GenBank發表的鵝細小病毒(GPV)B株全基因序列，針對VP3基因保守區，利用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0軟件設計合成了一對引物，由寶生物(大連)生物工程公司合成，擴增片段長度約為1500bp，序列如下:

P1:5′- CGC GGATCC GCC GAT GGA GTG GGT AAT GCC T - 3′

P2:5′- CCG CTCGAG CTG GTG AAC TGG ATT TCT GGG - 3′

1.2.2病毒核酸的提取

病毒核酸的提取按文獻(5)方法進行。

1.2.3VP3基因PCR擴增

PCR反應體系:滅菌去離子水:12.3micro;L，10x PCR Buffer:2micro;L，dNTP:1micro;L，P1:1micro;L，P2:1micro;L，鵝細小病毒DNA:2.5micro;L，Ex Taq:0.2micro;L。PCR反應程序:95℃預變性5min，94℃變性1min，53℃退火45s，72℃延伸2min，進行35個循環，最后于72℃再延伸5min。電泳鑒定:取5micro;L PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，-20℃保存備用。

1.2.4PCR產物的克隆

取50micro;L陽性PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用DNA凝膠回收試劑盒進行純化回收VP3基因片段。將回收的VP3基因與克隆載體pMD-18T simple進行連接，連接產物轉化至BL21感受態細胞中。挑取轉化后的陽性白色單菌接種于5mL含有氨芐青霉素的LB培養液中，37℃振蕩培養過夜，然后用質粒小量制備法提取質粒。將提取的重組質粒分別用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定和PCR鑒定。

1.2.5序列測定與分析

將鑒定陽性的重組質粒菌液送至上海生物工程技術有限公司進行測序。測序結果用DNAMAN、DNAstar軟件進行核苷酸序列和推導氨基酸序列的同源性分析。

1.2.6 目的基因與表達載體的連接和轉化

將酶切的目的基因與載體按3:l的體積混合，在T4DNA連接酶的作用下4℃過夜，將連接產物轉化至大腸埃希菌BL21感受態細胞涂布平板，挑取單個白色菌落提取質粒進行酶切和PCR鑒定。命名為PGEM-VP3。

2 結果

2.1 VP3基因PCR擴增

產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在1500bp處有一明顯的條帶，與預期片段大小相符，結果見圖1。

Fig 1 PCR amplification result of VP3 gene of GPV

M:DL2 000 DNA Marker;1:鵝細小病毒標準株DNA擴增產物; 2:病料中鵝細小病毒DNA擴增產物; 3:陰性對照:健康雛鵝臟器上清基因組DNA;4:空白對照:滅菌的去離子水

2.2重組質粒pMD18-VP3的PCR鑒定

將提取的重組質粒進行PCR擴增，在1500bp處有一清晰的條帶，與預期片段大小一致，結果見圖2。

Fig 2 Electrophoresis of amplification of recombinant plasmid YB

M:DL2 000 DNA Marker;1-2:重組質粒PCR擴增產物

3:陰性對照:健康雛鵝臟器上清基因組DNA;4:空白對照:滅菌的去離子水

2.3重組質粒pMD18-VP3雙酶切鑒定

重組質粒經BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切得到兩條特異性基因片段，一條約為1 500bp，另一條

約為2 700bp，所得結果與理論值相符。(見圖3)

Fig 3 Electrophoresis of resis of recombinant plasmid YB digested

by BamH Ⅰ and XhoⅠ

M1:DL2 000 DNA Marker; M2:DL 15 000bp DNA Marker;

1，2: BamH Ⅰ and XhoⅠ 雙酶切鑒定:片段大小約為1 500bp和2 700bp

2.4重組質粒pMD18-VP3的測序鑒定

測序結果與GenBank中發表B株的序列同源性為96.5 ，說明目的基因(VP3)已經被成功克隆到pMD18-T Simple載體上。

2.5 重組質粒pGEX-VP3的PCR鑒定和酶切鑒定

對初步篩選為陽性的重組亞克隆質粒為模板進行PCR擴增鑒定和雙酶切鑒定，結果與預期結果相符。

Fig 4 Identification for pGEX -VP3 by PCR and restriction enzyme digestion

M1:DL2 000 DNA Marker; M2:15000bP DNA Ladder Marker;

1: BamH Ⅰ and XhoⅠ 雙酶切鑒定:片段大小約為1 500bp和4 900bp

2:重組質粒PCR擴增產物

3 討論

由于原核表達系統常受到目的基因本身結構、轉錄水平調控和蛋白質折疊諸多因素的影響，本研究所用的融合表達載體pGEX-4T-1，該載體帶有非常強的tac啟動子，融合蛋白表達系統可以克服轉錄與轉錄后水平對外源基因表達帶來的不利影響，是一種高效的蛋白表達載體，GST標簽便于目的蛋白的進一步純化。

VP3是鵝細小病毒主要衣殼蛋白，約占衣殼蛋白總含量的80%，能夠刺激機體產生中和抗體，Zadori等通過GPV與AAV2衣殼蛋白三維結構模擬比較分析發現，VP3可能是暴露于鵝細小病毒表面的多肽，內含有鵝細小病毒主要抗原決定簇成分，是鵝細小病毒主要免疫保護性抗原，能誘導機體產生具有中和作用的抗體。因此本試驗以pGEX-4T-1為載體，構建了pGEX-VP3原核表達質粒，為亞單位疫苗的構建奠定了基礎。

參考文獻:

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[7] 薩姆布魯克J，拉塞爾DW.分子克隆實驗指南[M].第三版.北京:科學出版社，2OO2.

作者簡介:金東春(1969-)，男，朝鮮族，延邊大學農學院動物醫學系，博士。

第二作者簡介:杜秋明(1986—)，男，漢族，吉林省舒蘭市人，延邊大學農學院動物醫學系預防獸醫學專業，在讀碩士. 研究方向:動物傳染病。

基金項目:吉林省牧業管理局項目;項目編號:吉牧科字第200902號;