黑籽南瓜離體再生體系與轉基因技術研究

李長生　趙傳志　李愛芹　夏　晗

摘要：以黑籽南瓜為試驗材料，子葉為外植體，建立了黑籽南瓜組織培養再生體系，并對轉基因常用的抗生素濃度進行了篩選。試驗結果表明：萌發4天的子葉是誘導芽再生的最佳外植體，MS+1.0mg／L BA是誘導芽再生的最適培養基，1／2MS+0.5mg／L GA₃是適合再生苗壯苗和生根的培養基。100mg／L卡那霉素、50ms／L潮霉素適于南瓜的轉基因，初步的轉基因研究驗證了此轉化體系的有效性。

關鍵詞：黑籽南瓜；組織培養；轉基因

中圖分類號：S642.903.6文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2009)07-0008-04

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia Bouche，)屬于葫蘆科南瓜屬。栽培南瓜及其野生近緣種均起源于美洲，廣泛分布于世界各地，我國栽培的南瓜屬植物主要有美洲南瓜、印度南瓜和中國南瓜。南瓜屬植物不僅是重要的蔬菜來源，還具有保健和觀賞作用。黑籽南瓜是南瓜屬中種子為黑色的栽培種，染色體數2n=2x=40，起源于中美洲的高原，現分布于墨西哥中部、中美洲至南美洲智利的廣大地區，果實產量高，是優良的飼料。黑籽南瓜生長勢強，生長要求溫度低，其根系在較低的地溫下伸長能力強，發育良好，對葫蘆科蔬菜枯萎病抗性強，嫁接親和性好，是嫁接黃瓜的常用砧木。

雖然黑籽南瓜作為砧木能夠在很大程度上減少土傳病害，但隨著保護地面積的擴大，規模化種植和連作的加重，土傳病害(如黃瓜枯萎病、疫病等)的變種激增，新病害不斷出現，防治難度加大。調查發現，當前大棚土傳病害已上升為主要病害。對壽光市170棟大棚蔬菜隨機調查發現，土傳病害發生嚴重的占73.2％，其中根結線蟲發生嚴重和較嚴重的占42.5％；對濟源市2500棟溫棚蔬菜調查顯示，每年都發生土傳病害的占95％，其中根結線蟲占35％；中等程度發生的占52.5％，嚴重發生的占23.4％。目前我國設施蔬菜病害仍以化學防治為主，過量、頻繁施用化學殺菌劑的現象普遍存在，對土壤環境危害嚴重。近年來，生物工程方法在作物病害防治領域得到廣泛應用，并取得了良好的效果，利用轉基因方法將抗病基因轉入黑籽南瓜，既能提高其抗病性，又不會將外源基因轉入黃瓜。穩定的離體再生和轉化系統是基因改良黑籽南瓜品種的前提，雖然南瓜的組培體系已有報道，但其再生頻率仍然較低，且不同南瓜栽培種的離體再生條件不盡相同。本研究以砧木用黑籽南瓜子葉為外植體，對影響其再生的激素種類及其濃度進行篩選，并在此基礎上將帶有潮霉素抗性標記的植物表達載體成功轉入黑籽南瓜，對利用轉基因方法改造黑籽南瓜的抗病性做了有益探索。

1材料與方法

1.1材料

挑選飽滿的黑籽南瓜種子，蒸餾水中浸泡30min，剝去種皮，70％乙醇滅菌30s，無菌水沖洗2次，2.5％次氯酸鈉滅菌15min，無菌水沖洗3次以上，在無激素的1／2MS培養基上培養，培養溫度為(26±2)℃，培養3～8d，以發芽的種子制備外植體。

1.2方法

1.2.1黑籽南瓜離體再生體系的建立以MS為芽再生的基礎培養基，NAA設0、0.02、0.05、0.1mg／L四個濃度，BA設0.5、1、4 mg／L三個濃度，篩選最合適芽誘導的培養基。以1／2MS為再生芽生根的基礎培養基，配合NAA和GA₃，篩選最適合根誘導的培養基。

1.2.2黑籽南瓜外植體對常用轉基因標記抗生素濃度敏感性篩選對常用的轉基因再生苗抗生素篩選標記進行外植體敏感性試驗，篩選適宜的抗生素濃度，其中卡那霉素設50、100、150mg／L三個濃度，潮霉素設20、30、50、80mg／L四個濃度，添加到芽誘導培養基中，觀察芽再生情況和外植體的反應。

1.2.3黑籽南瓜轉基因技術體系將帶有潮霉素抗性篩選標記的植物表達載體pCAMBIA1381z轉入農桿菌菌株C58C1，子葉在過夜培養的農桿菌中浸泡10min，用無菌濾紙除去多余菌液，將子葉置于芽誘導培養基上暗培養2天，外植體轉移到添加30mg／L潮霉素和200mg／L頭孢霉素的芽誘導分化培養基上。潮霉素抗性再生苗經壯苗和生根后，取葉片提取DNA進行PCR擴增，檢測潮霉素抗性基因。

2結果與分析

2.1黑籽南瓜外植體離體再生情況

取萌發3～7天的無菌子葉，從葉柄處切斷，將子葉橫向一分為二，置于分化培養基上，10天后子葉膨大，在傷口處出現愈傷組織(圖1A)；20天后在愈傷組織附近出現再生芽(圖1B)或再生根。在萌發3～7天的子葉中，發現萌發4天剛剛開始變綠的子葉分化能力最強，出愈率達到100％，芽分化率達到60％以上，而其它發育時期子葉外植體芽分化率在40％以下。對外植體愈傷組織發生位置的觀察發現，子葉切口處均有愈傷組織，但只有靠近葉柄處的愈傷組織能夠再生出芽，故在后續試驗中采用萌發4天的子葉作為外植體，外植體切割時留有小段葉柄。

2.2黑籽南瓜離體再生體系的建立

由表1可看出，在MS基本培養基上，當BA濃度為1.0mg／L時，隨著NAA濃度的增大，黑籽南瓜子葉再生芽頻率呈逐漸降低趨勢，且不添加NAA的處理其不定芽再生率最高(66.7％)；當BA的濃度大于或小于1.0mg／L時，黑籽南瓜不定芽再生率均為0。可見，最適合黑籽南瓜芽再生的培養基為MS+1.0mg／LBA。

另外，試驗還發現，適合黑籽南瓜再生苗生長的基礎培養基為1／2MS培養基，最適合其根誘導和壯苗的培養基為1／2MS+0.5mg／LGA₃，再生苗可以在不添加生長素類激素的1／2MS培養基上正常生根(圖1C)。

2.3常用抗生素對黑籽南瓜外植體再生的影響

選用轉基因常用的潮霉素、卡那霉素，觀察不同抗生素對黑籽南瓜外植體植株再生的影響。結果(表2)表明，在添加20、30mg／L潮霉素或添加50mg／L卡那霉素的分化培養基上，大部分外植體可以形成愈傷組織，出愈率達到90％以上；在50mg／L潮霉素或100mg／L卡那霉素的培養基上，外植體出愈率降低，少數外植體分化出黃化再生芽；在80mg／L潮霉素或150mg／L卡那霉素的培養基上，個別外植體能形成愈傷組織，大部分外植體在培養2周后枯萎死亡。可見，可選用50mg／L的潮霉素和100mg／L卡那霉素作為黑籽南瓜轉基因篩選的高限臨界濃度。

2.4黑籽南瓜轉基因體系的建立

采用以上篩選出的再生體系作為黑籽南瓜轉基因的基礎。將帶有潮霉素抗性篩選標記的植物表達載體pCAMBIA1381z，轉化農桿菌C58C1，侵染外植體，在分化培養基上以50mg／L的潮霉素篩選轉基因植株，以200mg／L的頭孢霉素作為抑菌素，培養20天后，分化出再生芽。再生芽長到1cm時轉入壯苗和生根培養基，2周后在幼苗上剪取葉片提取DNA，用潮霉素抗性基因引物檢測轉基因植株。9株再生苗中，陽性為2株，弱陽性5株(圖2)。

3討論

與其它植物一樣，南瓜屬植物也可以通過胚狀體和器官發生兩種途徑進行離體再生，但南瓜屬植物種和品種的多樣性使得其離體再生的條件差異較大，但目前南瓜的離體再生多采用子葉為外植體。本試驗結果表明，黑籽南瓜不同苗齡的子葉分化能力也不相同，以萌發4天，顏色開始變綠的子葉分化能力最強，這與其他研究者的結論相同。這可能是由于南瓜子葉在種子萌發過程中內源激素濃度變化顯著，而外植體內源激素濃度和比例與其分化能力密切相關。

有研究表明，中國南瓜誘導再生芽的過程需要BA的作用，但0.5-2mg／L的BA對其芽的誘導沒有很大區別，黃狼南瓜和錦粟2號南瓜的芽誘導和根誘導過程則需要分裂素和生長素的共同作用。本研究發現，黑籽南瓜誘導再生芽的最適培養基為MS+1.0mg／LBA，不需要NAA等生長素的配合，在子葉分化芽的過程中常常伴有根的分化，或只分化出根，說明外植體內源生長素積累較多，需要外加分裂素調節誘導芽的再生。同樣，在壯苗及生根培養基中也不需要生長素的配合，GA₃在培養后期起到促進芽伸長的作用。初步轉基因試驗表明，此再生和轉基因體系為基因工程改良黑籽南瓜種質打下了基礎。