甘薯軟腐病菌的分離鑒定及室內抑菌試驗

鐘麗娟　趙新海　張慶華　徐　沖

摘要：為了篩選有效控制甘薯軟腐病的藥劑，采用生長速率法測定了5種市售藥劑對甘薯軟腐病菌的抑菌作用。結果表明，80％多菌靈可濕性粉劑和70％甲基托布津超微可濕性粉劑對甘薯軟腐病菌有較明顯的抑制作用，其它藥劑無明顯防治效果。

關鍵詞：甘薯軟腐病；匍枝根霉；殺菌劑；抑菌試驗

中圖分類號：S435.313⁺.2文獻標識號：A文章編號：1001-4942(2009)07-0087-03

甘薯軟腐病(Rhizopus aolonifer)，是甘薯貯藏期的主要病害之一，在全國各甘薯生產區均有發生。該病由接合菌亞門的匍枝根霉(黑根霉)Rhi-wpus aolonifer(Ehr.ex.Fr.)Vuill，引起，在適宜條件下病情發展較快，往往導致甘薯全窖腐爛，因此在甘薯人窖前應先做好相應的預防工作。從收獲時避免傷口，淘汰病薯，到入窖前清理、熏蒸薯窖，甘薯藥劑處理乃至貯藏期間管理等各個步驟都要嚴格把關，才能保證甘薯安全貯藏，其中篩選防治甘薯軟腐病的有效藥劑對甘薯貯藏尤為重要。關于軟腐病的防治藥劑多數是網頁資料，未清楚表明藥劑的種類及使用濃度，并且即使同一主要成分的農藥，由于其生產工藝的差別、加入助劑的不同、防治對象的不同，都可能導致防治效果的差別。本試驗即對5種常用市售藥劑對甘薯軟腐病菌的抑菌能力進行了研究，旨在為甘薯貯藏前的藥劑處理提供依據。

1材料與方法

1.1甘薯軟腐病病原菌分離及鑒定

取薯皮有白色霉層，薯肉稍腐爛，表現明顯軟腐癥狀的甘薯，采用組織分離法，在無菌操作條件下，取已滅菌的培養皿，將甘薯病健交接處切成1cm³大小，放入培養皿中，先倒入70％酒精，進行表面潤洗幾秒鐘，倒出酒精，再倒入0.1％升汞液適量作表面消毒1min。消毒后倒出升汞液，用無菌水沖洗2～3次。用滅菌的鑷子夾取剪好的材料，過火焰去些水分后，放入培養基平板上，輕輕按壓。每個培養皿4～5塊，排放均勻。用記號筆在培養皿上注明分離代號、日期、名稱，將培養皿用紗布包好，翻轉放置于23～25℃培養箱中培養。2d后挑選由分離材料上長出的典型而無雜菌的菌落，在顯微鏡下鏡檢，確定為黑根霉后，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養基一小塊，轉入試管斜面培養基中央，于25℃溫箱中培養，待生長好后放入冰箱保藏。

1.2甘薯軟腐病病原菌的致病性驗證

由于根霉在空氣中廣泛存在，是實驗室最常見的污染菌之一，為了證明所分離的根霉確實是甘薯軟腐病的致病菌，需要通過柯赫氏證病法則進行驗證，即進行病菌的回接試驗。

取同一品種的健康甘薯洗凈去皮，表面用70％酒精消毒，然后用無菌的解剖刀將甘薯切成1.5cm厚的甘薯片，用打孔器打取已經活化的病菌菌苔，菌絲面朝下接種于薯片中央位置，將薯片置于培養皿中，于25℃恒溫培養箱內培養，2～3d后觀察發病情況。再次采用常規組織分離法，進行分離，培養后于顯微鏡下觀察，比較兩次分離所得的菌株形態上是否一致。

1.3.5種常用藥劑對甘薯軟腐病病菌的室內抑菌試驗

1.3.1供試藥劑及使用濃度80％多菌靈可濕性粉劑800倍液(上海龍燈化工有限公司，市售)；50％多菌靈可濕性粉劑800倍液(英國LK作物科學有限公司，市售)；70％甲基托布津可濕性粉劑800倍液(江蘇龍燈化學有限公司，市售)；純品佳托70％可濕性粉劑800倍液(陜西上路之格生物科學有限公司，市售)；甲托70％超微可濕性粉劑800倍液(西安美邦藥業有限公司，市售)。

1.3.2不同藥劑對甘薯軟腐病病菌菌絲生長的影響采用生長速率法測定殺菌劑對甘薯軟腐病菌的毒力。將供試藥劑分別用定量無菌水稀釋成所需濃度，取1ml稀釋液放入滅菌培養皿(直徑為90mm)，加PDA培養基9ml，充分搖勻，制成含藥的培養基，以加入等體積的無菌水的PDA平板為對照。培養基凝固后，用打孔器(直徑為10mm)制取已活化的病菌菌餅，菌絲面朝下接種于含藥PDA培養基中央，每處理重復3次，置于25℃恒溫培養箱內黑暗培養，2d后交叉測量供試病菌在含不同藥劑培養基上的菌落直徑，與對照比較計算各藥劑處理對菌落擴展的生長抑制率，分析比較不同殺菌劑對供試病菌菌絲生長的影響。

抑菌率(％)=[(對照菌落直徑－10)－(處理菌落直徑－10)]／(對照菌落直徑－10)×100

2結果與分析

2.1甘薯軟腐病病菌分離與鑒定結果

通過鏡檢發現，所分離的真菌菌絲無色，有匍匐根，根節處簇生直立暗褐色孢囊梗，頂端著生1個球狀孢子囊，囊內產生很多暗色單胞圓形孢子，單胞大小為11－14μm，與根霉的形態特征一致，至于是空氣中的病菌還是甘薯軟腐病的致病菌需要經柯赫氏法則的進一步驗證。

2.2甘薯軟腐病病菌致病性驗證結果

柯赫氏法則規定：(1)在發病植物上常伴隨有一種病原生物存在；(2)該微生物可在離體的或人工培養基上分離純化而得到純培養；(3)將純培養接種到相同品種的健株上，表現出相同癥狀的病害；(4)從接種發病的植物上再分離到其純培養，性狀與原來的記錄相同。回接試驗的結果顯示，在接種菌苔周圍的薯塊表面長出白色棉狀菌絲，并生出灰黑色小粒，病情發展很快，到接種第3d時，薯塊已經變軟，表現出黃褐色或淺褐色腐爛，并且有酒味或酸臭味。與試驗時所取病薯表現癥狀特點一致，然后將其再次分離，培養基上長出與第一次分離的病菌形態和顏色相同的病原菌；于顯微鏡下對病原菌形態進行觀察，鑒定所分離的病菌即為甘薯軟腐病的病原菌匍枝根霉Rhizopm stolonifer(Ehr.ex.Fr.)Vuill。

2.3不同藥劑對甘薯軟腐病病菌菌絲生長的抑制效果

由表1可見，供試的5種藥劑中，上海龍燈化工有限公司生產的80％多菌靈和西安美邦藥業有限公司銷售的甲托70％超微粉對匍枝根霉的菌落生長有強的抑制作用，抑菌率達90％以上，而其它試劑對甘薯軟腐病病菌無明顯的抑制作用，抑制率僅在13.25％-21.69％之間。

3結論與討論

通過5種常用藥劑對甘薯軟腐病病菌抑菌效果的初步測定，篩選出抑菌效果較好的兩種藥劑，結果表明：80％多菌靈可濕性粉劑和甲托70％超微可濕性粉劑抑菌效果好，可以作為甘薯貯前處理藥劑。本試驗主要考察了苯并咪唑類廣譜性農藥對軟腐病病菌的抑制效果，試驗結果也表明即使同一主要成分的農藥，由于其生產工藝的差別、加入助劑的不同、防治對象的不同，都能導致抑菌效果的差別，當然，由于試驗中所用的農藥均購自農藥市場，也不能排除存在假冒偽劣農藥的可能，所以在甘薯貯前，進行前期的藥劑篩選預備試驗也顯得尤其重要和必要。