反復(fù)力竭游泳應(yīng)激對大鼠海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元型一氧化氮合酶表達的影響

摘 要：為探討海馬結(jié)構(gòu)(海馬和齒狀回)神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)與運動疲勞應(yīng)激的關(guān)系，觀察反復(fù)力竭游泳所引起的疲勞應(yīng)激對大鼠海馬結(jié)構(gòu)nNOS表達的影響。經(jīng)4周力竭游泳訓(xùn)練制成大鼠運動疲勞應(yīng)激模型，用免疫組織化學(xué)方法顯示海馬和齒狀回nNOS陽性神經(jīng)元，用圖像處理半定量方法對該神經(jīng)元的數(shù)量、面積和灰度進行測量和分析。結(jié)果顯示：應(yīng)激實驗組大鼠海馬和齒狀回nNOS免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量、面積和灰度均明顯大于對照組(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。運動疲勞應(yīng)激可使大鼠海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元nNOS上調(diào)，該神經(jīng)元參與運動疲勞應(yīng)激的形成，其機理可能與海馬對情緒記憶和齒狀回對應(yīng)激反應(yīng)的l心理行為調(diào)節(jié)以及NO的神經(jīng)毒性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：疲勞；應(yīng)激；海馬結(jié)構(gòu)；神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)；大鼠

中圖分類號：G804.4文章編號：1009—783X(2010)04—0093—04 文獻標志碼：A

運動性疲勞是運動醫(yī)學(xué)研究的熱點之一，除了周圍神經(jīng)肌肉疲勞引起的生理病理變化逐漸被研究者了解以外，運動疲勞時中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的生理病理變化報道較少，其機制復(fù)雜且受精神心理等因素的影響，未取得一致的結(jié)論。本課題組對疲勞應(yīng)激時腦內(nèi)下丘腦、杏仁體和伏隔核等神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)的表達進行了系列研究，證明反復(fù)力竭游泳應(yīng)激與大鼠腦內(nèi)某些核團NO／nNOS有一定關(guān)聯(lián)。

海馬結(jié)構(gòu)(hippocampal formation，HF)包括海馬(hippo—campus)和齒狀回(dentate gyrus)，共屬于邊緣系統(tǒng)，是腦發(fā)育較古老的結(jié)構(gòu)。海馬和齒狀回在發(fā)生發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能上有密切聯(lián)系，如參與學(xué)習(xí)、記憶和情緒反應(yīng)等。海馬既介導(dǎo)應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)和可塑性調(diào)節(jié)，又參與學(xué)習(xí)記憶及情緒反應(yīng)等精神活動，故成為探討應(yīng)激與神經(jīng)精神疾病(包括運動性中樞疲勞)相互關(guān)系研究中的熱點之一。為進一步了解疲勞應(yīng)激時其他重要神經(jīng)核團一氧化氮合酶(NOS)的變化，本文應(yīng)用大鼠反復(fù)力竭游泳模型和免疫組織化學(xué)方法對海馬結(jié)構(gòu)與疲勞應(yīng)激的關(guān)系進行了探討。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

雄性Wister大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)20只，體重180—200g，隨機分為疲勞應(yīng)激組10只，對照組10只。標準嚙齒類飼料飼養(yǎng)，活動自由，適應(yīng)環(huán)境3d，記錄動物體重。室溫(20±2)℃，濕度(45±10)％，光照每天14h。

1.2 游泳訓(xùn)練模型

1.2.1 游泳環(huán)境

游泳池為圓形，內(nèi)徑50cm，水深60cm，水溫控制在(30±1)℃。

1.2.2 力竭游泳方案

實驗組適應(yīng)性游泳3d，剔除不擅游泳者。每天力竭游泳1次，每周6d。力竭游泳標準為：大鼠游泳動作失協(xié)調(diào)，水淹沒鼻尖，身體下沉，至再次浮出水面的時間超過10s，并連續(xù)3次者。提出水面后頭不能抬起，無力掙扎逃跑。對照組大鼠佯裝游泳，即在同樣條件下2—3cm水深中跋涉。

1.2.3 疲勞應(yīng)激模型建立

4周游泳訓(xùn)練后大鼠精神萎靡，食量下降，反應(yīng)性降低，脫毛，體重不增或略有降低，提示運動性疲勞已經(jīng)形成。

1.3 取材切片

大鼠經(jīng)2％戊巴比妥鈉(45mg／kg)腹腔麻醉后，開胸，升主動脈插管，用300ml冷生理鹽水快速沖洗，直至流出液體變清為止。繼之灌入4％多聚甲醛(0.1moI／L PBS，pH7.4—7.4，下同)300mI，再以10％蔗糖PBS溶液300ml灌注。灌注結(jié)束立即取腦，置于4％多聚甲醛PBS溶液中，4℃后固定3h，然后移入20％蔗糖PBS溶液中，4℃保存過夜。作腦冠狀位連續(xù)冰凍切片，片厚40μm。

1.4 ABC免疫組織化學(xué)染色

兔抗nNOS血清(抗體稀釋度為1：100)，兔ABC試劑盒和DAB等，均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。冰凍切片經(jīng)室溫平衡，水化后按以下步驟進行。切片經(jīng)0.5％TritonX-100PBS液孵育，37℃，1h；10％正常羊血清封閉，37℃，1h；加入兔抗nNOS血清第一抗體，37℃孵育3h后，4℃孵育36h；加入生物素化羊抗兔第二抗體(稀釋度為1：100)，37℃孵育1h；后入卵白素生物素復(fù)合物(稀釋度為1：100)中，37℃孵育1h；以上各步驟之間均用PBS漂洗5min×3次；DAB呈色，緩沖液中止顯色，反復(fù)漂洗。0.2％明膠裱片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

陰性對照組：分別以正常兔血清和PBS代替第一抗體孵育，對照組未發(fā)現(xiàn)陽性物出現(xiàn)，即無特異性反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)土標準差表示，顯著性差異用Ex—cel軟件做t檢驗分析，以P<0.05為顯著性界值。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡觀察

光鏡下海馬各部和齒狀回nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元呈棕褐色，免疫反應(yīng)產(chǎn)物位于神經(jīng)元胞體和突起的胞漿內(nèi)，染色均勻，細胞核不著色。神經(jīng)元呈錐形和卵圓形，為大中型細胞，突起較多。疲勞應(yīng)激組nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量均大于對照組(如圖1所示)。選取海馬CAl－3和齒狀回陽性神經(jīng)元進行圖像分析。

2.2 圖像分析

采用Q550CW型(德國Leica)數(shù)碼生物顯微鏡和JD-801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達)，參照大鼠腦立體定位圖譜確定核團部位，對海馬各部和齒狀回nNOS免疫陽性物質(zhì)進行半定量測定。每只大鼠隨機選取8—10處觀測點，每處視野面積約為50 00 μm2，在400倍鏡下分別讀取陽性細胞個數(shù)、陽性細胞面積和灰度。結(jié)果如圖2-5所示。

結(jié)果顯示：疲勞應(yīng)激組大鼠CAl區(qū)、CA2區(qū)和CA3區(qū)nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量(19.25±12.89)個、(9.78±2.82)個、(15.89±4.70)個；面積(5443.19±5621.01)μm²、(2098.46±1428.55)μm²、(3002，50±2440.25)μm²；灰度(99.30±10.64；100.143±19.30；94.03±22.22)均顯著大于對照組。齒狀回nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量(3.88±1.25)個、面積(489.15±318.34)μm²和灰度(91.294±21.24)均大于對照組。

3 討論

反復(fù)大強度游泳訓(xùn)練過程中出現(xiàn)的疲勞應(yīng)激是一種非創(chuàng)傷、非疼痛性應(yīng)激。目前認為應(yīng)激可以引起機體免疫功能低下、情感異常、交感神經(jīng)活性增高、血壓升高和神經(jīng)內(nèi)分泌功能改變。應(yīng)激特別是運動應(yīng)激與NO／NOS有關(guān)。

NO是一個具有廣泛生物學(xué)作用的生物活性因子，參與介導(dǎo)神經(jīng)傳遞、血管調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)等過程。NOS是體內(nèi)合成NO的關(guān)鍵酶，其中nNOS主要分布于神經(jīng)元中，在突觸可塑性與神經(jīng)再生、神經(jīng)傳導(dǎo)與神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)與行為調(diào)控方面起著非常重要的作用。NO不僅參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，而且是活潑的自由基，參與多種組織缺血缺氧的損傷過程，當NO異常表達時表現(xiàn)為明顯的神經(jīng)毒性作用。據(jù)最新報道，海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元對內(nèi)源性和外源性NO所致神經(jīng)毒性具有抵抗作用，而且NO對海馬突觸的可塑性有很大影響，并參與外周及中樞水平的痛覺調(diào)制，因此，NO對神經(jīng)元的作用具有二重性，既有保護性又有神經(jīng)毒性。

海馬結(jié)構(gòu)既受應(yīng)激刺激的影響又參與應(yīng)激的調(diào)節(jié)。海馬富含各種信使受體，是應(yīng)激激素作用的一個靶區(qū)，具有可塑性并極易受損。慢性應(yīng)激可導(dǎo)致海馬興奮性毒性損傷及行為的改變。海馬中的NO作為神經(jīng)遞質(zhì)參與其他神經(jīng)遞質(zhì)的功能活動，如Ach、NE、GABA的釋放，參與熱應(yīng)激所致的海馬CAl區(qū)神經(jīng)元損傷口。捕食應(yīng)激時大鼠海馬NO／nNOS表達增多。疲勞應(yīng)激大鼠海馬中谷氨酸／GABA比值明顯下降，提示興奮性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸在慢性應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用，而興奮性氨基酸抑制劑GABA可能也參與應(yīng)激反應(yīng)。除此之外，慢性應(yīng)激反應(yīng)可引起海馬頂樹突萎縮和超微結(jié)構(gòu)重排等形態(tài)學(xué)改變。齒狀回也與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，游泳應(yīng)激可誘導(dǎo)齒狀回c-fos陽性細胞的表達，但通過哪些途徑參與損傷海馬結(jié)構(gòu)，機理不詳。目前認為高糖皮質(zhì)激素和興奮性氨基酸(如谷氨酸)過高可能是引起海馬結(jié)構(gòu)損傷的主要原因。本文通過對nNOS的研究，試圖探討NO參與海馬結(jié)構(gòu)應(yīng)激損傷的病理過程和機制。

據(jù)報道，隨著應(yīng)激刺激強度的加大，NOS陽性神經(jīng)元的分布范圍增大(從下丘腦、杏仁體遍及腦干)，NOS活性增強，即NO的產(chǎn)生增多，但應(yīng)激刺激時海馬nNOS陽性神經(jīng)元的分布和含量變化未見報道。本實驗通過對反復(fù)游泳所致的疲勞應(yīng)激大鼠海馬結(jié)構(gòu)nNOS半定量研究發(fā)現(xiàn)，疲勞應(yīng)激組大鼠海馬結(jié)構(gòu)各部nNOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量、面積和灰度值均明顯大于對照組。提示游泳疲勞應(yīng)激可使大鼠海馬結(jié)構(gòu)nNOS表達增多，超出海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元抗NO毒性能力時，最終導(dǎo)致機體進入疲勞狀態(tài)。此結(jié)果與本課題組前期對下丘腦和杏仁體等核團的研究結(jié)果一致，也與慢性復(fù)合應(yīng)激海馬各亞區(qū)細胞密度均明顯增高的結(jié)果相一致。

由此看來，海馬結(jié)構(gòu)中NOS神經(jīng)元參與了中樞性疲勞應(yīng)激的形成，其機理可能與海馬結(jié)構(gòu)對應(yīng)激反應(yīng)的心理行為調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及NO的神經(jīng)毒性有關(guān)，但是，海馬結(jié)構(gòu)的功能聯(lián)系非常復(fù)雜，其在疲勞應(yīng)激反應(yīng)中的確切作用和機理仍然不清楚。本實驗可為深入探討海馬結(jié)構(gòu)參與疲勞應(yīng)激形成和調(diào)控提供部分實驗依據(jù)。