關(guān)于補(bǔ)腎方的藥性分析

摘要:骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，是導(dǎo)致老年人肢體功能障礙的主要原因。主要的病理特征是軟骨質(zhì)的降解和軟骨中細(xì)胞數(shù)目明顯減少，軟骨基質(zhì)的合成和分解代謝失調(diào)，最終關(guān)節(jié)軟骨被破壞。而軟骨中唯一的細(xì)胞是軟骨細(xì)胞，軟骨基質(zhì)主要是由軟骨細(xì)胞合成和分泌的。因此，軟骨細(xì)胞的分裂增殖及凋亡的異常在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起到十分重要的作用。補(bǔ)腎方藥臨床治療骨關(guān)節(jié)炎療效顯著。

關(guān)鍵詞:補(bǔ)腎方 性能 分析

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，是導(dǎo)致老年人肢體功能障礙的主要原因。主要的病理特征是軟骨質(zhì)的降解和軟骨中細(xì)胞數(shù)目明顯減少，軟骨基質(zhì)的合成和分解代謝失調(diào)，最終關(guān)節(jié)軟骨被破壞。而軟骨中唯一的細(xì)胞是軟骨細(xì)胞，軟骨基質(zhì)主要是由軟骨細(xì)胞合成和分泌的。因此，軟骨細(xì)胞的分裂增殖及凋亡的異常在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起到十分重要的作用。補(bǔ)腎方藥臨床治療骨關(guān)節(jié)炎療效顯著，本研究主要從補(bǔ)腎方藥對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響，探討其防治骨關(guān)節(jié)炎的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠，180～200g，雌雄各5只，由醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試劑 胎牛血清(美國(guó)Sigma，使用前滅活)、Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Sigma)、1.0g/L胰蛋白酶、0.2g/LEDTA、DMEM培養(yǎng)液(Gibco)、二甲基亞砜、MTT(美國(guó)Sigma)、TUNEL成套試劑盒。

1.3 鼠血清制備 Wistar大鼠14只，雌雄各半。補(bǔ)腎方(為經(jīng)驗(yàn)方，由淫羊藿、牛膝、黃芪等組成)組，按體表面積折算動(dòng)物的等效劑量，再按5ml/d灌胃，正常鼠血清以9.0g/L氯化鈉注射液按5ml/d灌胃。連續(xù)灌胃2次，中間間隔2h，分別在末次灌胃后3h采血。在乙醚和氯胺酮復(fù)合麻醉下鼠腹主動(dòng)脈采血，4℃冰箱過(guò)夜后，離心(2500r/min)25min，取上清液，抽濾除菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)取Wistar大鼠(180～200g)，處死大鼠后，無(wú)菌條件下取下股骨頭，髕骨，股骨髁，脛骨平臺(tái)軟骨，將軟骨剪碎，以PBS清洗兩次，0.25%胰酶消化30min，去除胰酶，PBS清洗兩次，以1:10的比例加入0.2%的II型膠原酶溶液，置37℃水浴中輕微振蕩，消化4h，直至軟骨組織塊基本消失，溶液變渾濁為止，以1500r/min離心10min，去上清，加入PBS清洗細(xì)胞，在細(xì)胞團(tuán)中加入含10%FBS的DMEM全培養(yǎng)基(含100U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素，10-8M地塞米松，VitC50μg/ml)，將細(xì)胞團(tuán)制成懸液，以200目篩網(wǎng)過(guò)篩，收集濾液，以6×106/ml密度接種，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，首次換液在3d后，其后每2d換液1次，至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶時(shí)傳代。

1.5 含藥血清的加入 傳代細(xì)胞接種在24孔板中，接種密度2×104個(gè)/cm2，分對(duì)照組(正常血清)、補(bǔ)腎方實(shí)驗(yàn)組(含藥血清分別為5%，10%，20%)。每組選6個(gè)培養(yǎng)孔，分別用相應(yīng)的血清培養(yǎng)。

1.6 MTT增殖測(cè)定軟骨細(xì)胞培養(yǎng)5d后，每孔加MTT20μl(5 mg/ml)溶于PBS中，濾過(guò)除菌，放入培養(yǎng)箱4h，取出，每孔加入50μl二甲基亞砜，振蕩混勻使結(jié)晶物充分溶解。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)光密度(OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為492nm。

1.7 TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞的凋亡按檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以胞漿出現(xiàn)棕色細(xì)小顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性率計(jì)算:計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞核(胞漿)數(shù)及總細(xì)胞核數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)占細(xì)胞核總數(shù)的百分比。

1.8 數(shù)據(jù)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

不同濃度的補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞均顯示增殖刺激作用，與對(duì)照組比較P<0.05。不同濃度的補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，差異存在顯著性P<0.05。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種臨床常見(jiàn)的老年人關(guān)節(jié)的退行性病變，它的發(fā)病率與年齡密切相關(guān)。Cooper等研究表明，60歲后，100%的人膝關(guān)節(jié)軟骨將發(fā)生組織學(xué)退變;60%～70%的個(gè)體存在確定的膝OA證據(jù)。我國(guó)50歲以上的人群中骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率約為50%，而65歲以上患有此病的女性和男性分別高達(dá)90%和80%。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞，它與由其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)共同組成具有獨(dú)特力學(xué)和生物學(xué)特性的物質(zhì)，即軟骨。因此，軟骨細(xì)胞在軟骨形成、代謝以及修復(fù)中起著極其重要的作用。骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨丟失以及軟骨細(xì)胞功能降低或喪失為主要特征的一類(lèi)退行性關(guān)節(jié)疾病。但軟骨的修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的組織學(xué)變化過(guò)程，軟骨細(xì)胞在骨關(guān)節(jié)炎修復(fù)中起著十分重要的作用。如何促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和延緩軟骨細(xì)胞凋亡，是需要研究的問(wèn)題。

中醫(yī)藥學(xué)在骨關(guān)節(jié)病的臨床治療中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，為了進(jìn)一步研究中醫(yī)藥延緩軟骨退變的作用機(jī)理，有必要建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。而中藥復(fù)方多數(shù)是通過(guò)口服而起作用的，用中藥粗制劑直接加入離體反應(yīng)體系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，在方法學(xué)上存在很多問(wèn)題，如:中藥中的雜質(zhì)成分、各種電解質(zhì)或鞣質(zhì)、以及不同酸堿度的影響等，都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。而用含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，可以排除以上各種因素的影響，比較接近藥物體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的過(guò)程。MTT光密度表達(dá)，反映了細(xì)胞增殖活性，反映一定時(shí)間的細(xì)胞增殖速度。細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法主要包括形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等改變。其中最重要和特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴(lài)性核酸內(nèi)切酶的激活導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核心小體連接部位斷裂，形成以180～200bp為最小單位的單體或寡聚體片段。因此，細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA降解所產(chǎn)生的DNA片段大小具有獨(dú)特性質(zhì)，常作為細(xì)胞凋亡特異性指標(biāo)，其中TUNEL法則被廣泛應(yīng)用的方法之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥補(bǔ)腎方含藥血清各濃度組的軟骨細(xì)胞增殖OD值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明其能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增生;而軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明其具有抑制軟骨細(xì)胞的異常凋亡的功效;說(shuō)明中藥補(bǔ)腎方能通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞異常凋亡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖從而起到防治骨關(guān)節(jié)炎的作用。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是中藥補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的直接作用，其作用機(jī)理有待深入探討。

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