NS-398和抗癌藥聯(lián)用對胃癌細胞增殖的影響

[摘要] 目的 探討選擇性環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑NS-398和抗癌藥5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)用對胃癌細胞增殖的影響。方法 不同濃度的NS-398與10μg/mL的5-FU單用、聯(lián)用48h。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組抑制率，應(yīng)用中效原理和金正均法判定選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑與抗癌藥聯(lián)用的效果。結(jié)果 兩藥單獨應(yīng)用時藥物濃度和抑制率呈量效關(guān)系，其效應(yīng)隨藥物濃度的增加而增加;兩種藥物聯(lián)用抑制率均高于單用，具有協(xié)同作用。結(jié)論 NS-398與5-FU聯(lián)用后起協(xié)同作用，可以作為5-FU的化療增敏劑。

[關(guān)鍵詞] 胃腫瘤; 環(huán)氧合酶抑制劑; 化療藥物; 生長抑制

[中圖分類號] R735.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)03-16-02

胃癌是我國最常見的三大腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率都超過了世界平均水平。聯(lián)合用藥是臨床上治療腫瘤的常用策略，其目的是為了獲取協(xié)同作用[1]。研究表明，抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)在非甾體抗炎藥(NASAIDs)腫瘤化學(xué)預(yù)防中起重要的作用。在人類多種腫瘤中，包括消化道腫瘤均存在過表達[2，3]。另外研究發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑可抑制多種腫瘤的生長[4]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床上治療胃癌等消化道系統(tǒng)腫瘤的常用藥物。本實驗觀察環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398和抗癌藥5-FU單用和聯(lián)用時對體外培養(yǎng)的人胃癌細胞系SGC-7901生長的抑制作用，為胃癌的治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細胞株SGC-7901(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫)、NS-398(美國Cayman公司)、5-FU(Sigma公司)，RPMI- 1640培養(yǎng)基(美國Gibco BRL公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(淮安和元化工有限公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT)(北京夏斯生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器

倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)、超低溫冰箱(日本Sanyo公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國Revco)、公司無菌工作臺(北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所)、紫外分光光度計(美國Gene Company Limited 公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 胃癌細胞株SGC-7901培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RMPI-1640的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，飽和濕度，2～3d傳代1次。

1.3.2 藥物的配制及濃度設(shè)計 按照說明書用DMSO分別溶解NS-398和5-FU配制成終濃度為1mmol/L的NS-398和1mg/mL的5-FU，各組的DMSO濃度不超過0.1%，本實驗設(shè)計的濃度為:10、100、1000μmol/L的NS-398和10μg/mL的5-FU。

1.3.3 MTT法檢測細胞的增殖活性 取對數(shù)生長期的SGC- 7901細胞，胰酶消化細胞，以每孔1×105個細胞接種于96孔板中，每孔體積200μL，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24h。分別加入DMSO溶解的不同濃度的NS-398(10、100、1000μmol/L)和10μg/mL的5-FU進行實驗。設(shè)各濃度NS-398單獨處理組、5-FU單獨處理組、各濃度NS-398與5-FU聯(lián)合處理組，每個處理組同時設(shè)DMSO對照組和SGC-7901細胞空白對照組，各四個復(fù)孔。加入相應(yīng)藥物和試劑孵育48h，孵育結(jié)束前4h加入5g/L的MTT溶液20μL。吸去上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，1h內(nèi)用分光光度計在570nm處測定吸光度(A)，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/細胞空白對照組A值)×100%。重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.4 藥物相互作用判斷 (1)中效原理[5]:兩藥合用指數(shù)(CI)<1時，有協(xié)同作用;CI>1時，有拮抗作用;CI=1時，有相加作用。(2)金正均[6]合并用藥相加原則:當(dāng)q>1.15時，有協(xié)同作用;q<0.85時，有拮抗作用;當(dāng)0.85≤q≤1.15時，有相加作用。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析進行組間比較，SNK-q檢驗法進行兩兩比較，并采用完全隨機設(shè)計的t檢驗對同一濃度的NS-398單用及其與5-FU聯(lián)合應(yīng)用進行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的NS-398單獨應(yīng)用對胃癌細胞的抑制作用

MTT結(jié)果顯示，NS-398對胃癌細胞的抑制率隨著劑量的增加而增加，各劑量組之間的抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 不同濃度的NS-398與5-FU聯(lián)用對胃癌細胞的抑制作用

與抗癌藥聯(lián)用時，抑制率均高于NS-398單用組和5-FU單用組，并顯示了較好的劑量依賴性，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。見表1、表2。

3 討論

COX-2是前列腺素合成過程中一個主要的限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺產(chǎn)物，從而參與機體的多種病理生理過程，如炎癥、發(fā)熱、出凝血機制等。主要有COX-1和COX-2兩種基因型，其中COX-2在許多腫瘤組織中高表達，在正常組織中不表達或弱表達，提示COX-2與腫瘤有關(guān)。

近年來COX-2與消化道腫瘤的關(guān)系日益受到重視，Thun等[7]研究發(fā)現(xiàn)COX-2在胃癌組織中高表達。應(yīng)用COX-2選擇性抑制劑治療和預(yù)防消化道腫瘤引起了人們的極大興趣，研究表明COX-2在胃癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用，特異性COX-2抑制劑NS-398依賴性抑制結(jié)腸癌細胞增殖[8]。

MTT實驗中吸光度值的大小可以反映細胞的增殖情況和代謝活性，因此應(yīng)用MTT比色法可定量反映藥物對細胞的生長抑制作用[9]。本研究通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398單獨應(yīng)用時能明顯抑制胃癌細胞的增殖，且有劑量依賴性;NS-398和5-FU聯(lián)用對SGC-7901的抑制作用強于兩藥單獨應(yīng)用時。

雖然研制和開發(fā)COX-2抑制劑已成為現(xiàn)今腫瘤治療的一個熱點，但直到現(xiàn)在COX-2抑制劑降低結(jié)腸癌和胃癌發(fā)病率的機制仍不是特別清楚。NS-398在腸道腫瘤主要通過誘導(dǎo)凋亡抑制腫瘤細胞生長[10]，但具體機制并不清楚。抗癌藥物作用于腫瘤細胞后并不能直接激活細胞凋亡程序，除藥物濃度過高或細胞毒對該藥物極其敏感的情況外，多數(shù)誘導(dǎo)細胞凋亡的抗癌藥最初是影響細胞的增殖潛能。5-FU是胃癌患者常用的化療藥物之一，但胃癌患者出現(xiàn)的對化療藥物不敏感和高耐藥性使其療效大大折扣。本研究表明選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398和5-FU聯(lián)用的效果大大強于兩藥單用時，有可能兩藥聯(lián)用使凋亡通路發(fā)揮了協(xié)同作用。因此，選擇性COX-2抑制劑和化療藥物的聯(lián)用將有可能成為胃癌治療的一種新方法。

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(收稿日期:2009-11-05)