超高效液相色譜-質譜/質譜測定禽蛋制品中三聚氰胺

摘 要:建立了超高效液相色譜-質譜/質譜測定禽蛋制品中三聚氰胺的方法。用2%乙酸溶液提取試樣中的三聚氰胺，提取液經乙腈稀釋后，以超高效液相色譜-質譜/質譜法測定。三聚氰胺的最低檢測限為0.05 mg/kg，加標回收率為89.4%～98.3%，相對標準偏差為3.35%～6.37%。

關鍵詞:超高效液相色譜-質譜/質譜;禽蛋制品;三聚氰胺

中圖分類號:O657.7+2文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2010)01-0090-04Determination of Melamine in Poultry Egg Products by UPLC-MS/MS

HU Mei，WANG Jun*，ZHANG Hui，ZHANG Xi-qi，ZHU Jian-hua

(Shandong Supervision Inspection Institute for Product Quality /

National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food， Jinan 250100， China)

Abstract A method for determination of melamine in poultry egg productsby UPLC-MS/MS was established. The sample was extracted with 2% acetic acid solution， diluted with acetonitrile， and then detected by UPLC-MS/MS. The detectable limit of melamine was 0.05 mg/kg. The recovery of melamine was 89.4%～98.3% with the RSD of 3.35%～6.37%.

Key words UPLC-MS/MS;Poultry egg products;Melamine

禽蛋制品包括咸鴨蛋、松花蛋等，作為我國傳統食品，由于味道鮮美、營養豐富，長期以來受到廣大群眾的喜愛。三聚氰胺簡稱三胺，學名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺，是一種重要的氮雜環有機化工原料， 白色結晶粉末，無味，常用于生產塑料、膠水、阻燃劑和化肥。由于不法商販將三聚氰胺添加到禽類飼料中，通過禽類的代謝而殘留于禽蛋中。關于禽蛋中三聚氰胺的檢測方法，國內外尚無相關的研究報道。目前報道的食品或飼料中三聚氰胺的檢測方法主要有液相色譜法[1，2]、液質聯用法[1，3，4]、氣質聯用法[1，5]、酶聯免疫法[6]等，由于基質復雜，均需經過固相萃取凈化或衍生化，操作繁瑣。本文在前人研究的基礎上，通過大量試驗，探索了禽蛋制品中三聚氰胺的快速測定方法，確定了以酸性提取劑提取，乙腈沉淀蛋白，免固相萃取凈化，超高效液相色譜-質譜/質譜定性、定量測定和確證的方法，應用于大量樣品檢測，效果理想。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈:色譜純;冰乙酸:分析純;2.0%乙酸溶液;乙酸銨:LC-MS用添加劑;微孔濾膜:孔徑0.22 μm，有機相;三聚氰胺標準品:純度為99.7%;三聚氰胺標準儲備溶液:準確稱取100.0 mg(精確到0.1 mg)三聚氰胺標準品于100 ml 容量瓶中，加入50 ml水溶解，用乙腈定容至刻度，配制成濃度為1.0 mg/ml 的標準儲備液，于4℃避光保存。

1.2 儀器 

ACQUITY UPLCTM -Waters Quattro Premier XE型超高效液相色譜-質譜/質譜儀，配有電噴霧離子源;分析天平:感量0.1 mg;均質機;漩渦混合器;低溫高速離心機:4℃，10 000 r/min。

1.3 樣品制備

鮮蛋類取10枚，去殼打成均勻蛋液;松花蛋及熟制蛋類各取10枚，去殼充分攪碎、混勻。分別置于可密封的潔凈容器中，編號，儲存于4℃冰箱中。

1.4 樣品處理

準確稱取2.00 g試樣 (精確到0.01 g)置于50 ml離心管中，準確加入2.0%乙酸溶液20 ml ，鮮蛋類樣品振搖、漩渦混合2 min，其它類樣品10 000 r/min 均質2 min，4℃、10 000 r/min離心5 min。取出恢復至室溫備用。

準確移取0.5 ml離心后提取液至10 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，充分混勻后靜置5 min，經0.22 μm有機相微孔濾膜過濾后待測。

1.5 標準曲線 

精確量取三聚氰胺標準儲備液適量，分別添加到2.00 g空白試樣中，添加濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/kg，混勻后放置10 min。按照與試樣相同的步驟處理后待測。

1.6 操作條件

1.6.1 色譜操作條件 色譜柱ACQUITY UPLCTM BEH HILIC(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相:A相為乙腈，B相為10 mmol/L乙酸銨水溶液;柱溫:40℃;進樣量:5 μl;梯度洗脫條件見表1。

表1梯度洗脫條件

時間(min)流速(ml/min)A(%)B(%)

0.00.3096.04.0

3.50.3088.012.0

3.60.4040.060.0

6.50.4096.04.0

5.90.4096.04.0

6.00.3096.04.0

注:以上流速和流動相比例變化均為線性變化。

1.6.2 質譜操作條件 離子源:電噴霧離子源，正離子;掃描方式:多反應監測;電離電壓:3.2 kV;離子源溫度:110℃;霧化溫度:400℃;錐孔氣流速:50 L/h;霧化氣流速:600 L/h;碰撞室壓力:3.6×10-3mPa.

1.6.3 其它參數 三聚氰胺的保留時間、定性定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量見表2，典型的質量色譜圖見圖1。

表2三聚氰胺參考保留時間、定性定量 離子對及錐孔電壓、碰撞能量

名稱保留時間(min)定性離子對(m/z)定量離子對(m/z)錐孔電壓(V)碰撞能量(eV)

三聚氰胺2.55127>85127>68127>85351625

圖1 空白基質中添加0.5 mg/kg三聚氰胺的質量色譜圖

2 結果與分析

2.1 色譜質譜條件的選擇

三聚氰胺分子量為126.12，分子中含有3個氨基，極性很強，在普通的反相液相色譜柱上幾乎沒有保留，多在死時間處出峰，難以定性、定量測定。本文采用了Waters公司的ACQUITY UPLCTMBEH HILIC色譜柱，該色譜柱采用親水性填料，對三聚氰胺等強極性化合物有較強的保留;同時由于采用1.7 μm的小顆粒填料，分離能力和分析速度大為提高。比較了乙酸銨、甲酸分別作為流動相添加劑的分離效果及對質譜信號的影響，結果表明乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，三聚氰胺的峰形不佳;以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，進行梯度洗脫，分離、峰形和靈敏度俱佳，最終決定采用該體系分離測定三聚氰胺。

將濃度為1.0 mg/L的三聚氰胺標準溶液，通過流動注射泵注入質譜儀，調諧并優化錐孔電壓、碰撞能量等參數，確定以127>85、127>68為定性離子對，其中127>85為定量離子對。若測得的樣品溶液和相同基質的標準溶液中三聚氰胺的保留時間一致，且定性離子對的相對豐度偏差符合表3的規定，則可判定樣品中存在三聚氰胺。

表3 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度50%20%～50%10%～20%≤10%

允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%

2.2 樣品前處理條件的選擇

在2008年出臺的測定乳制品中三聚氰胺的標準(GB/T 22388-2008)中，規定了液相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法、氣相色譜-質譜/質譜法三種測定方法均需采用固相萃取凈化，以消除基質中的雜質對測定的干擾。本研究采用了免固相萃取的快速前處理方法，經與固相萃取凈化的方法比較，定量結果無差異，但前處理時間縮短2/3，僅需15 min，且檢測成本大幅下降。雖然檢出限(0.05 mg/kg)略高于固相萃取凈化(0.01 mg/kg)的方法，但仍遠低于目前國內外食品中三聚氰胺的限量值(2.5 mg/kg)，可充分滿足各類檢測的要求。

考慮到三聚氰胺具有弱堿性，采用酸性提取劑有利于提高提取效率。比較了5種提取劑對鮮蛋和蛋制品中三聚氰胺的提取效果，分別為0.1 mol/L高氯酸溶液、0.1 mol/L鹽酸溶液、乙腈—0.1 mol/L鹽酸水溶液(1∶1)、2%甲酸溶液、2%乙酸溶液。結果表明，0.1 mol/L高氯酸溶液和0.1 mol/L鹽酸溶液用于提取鮮蛋中的三聚氰胺時，雖經乙腈沉淀蛋白，樣液仍難以經微孔濾膜過濾，易堵塞色譜柱;乙腈-水(1∶1)用于鮮蛋中三聚氰胺的提取時，蛋液凝固成膠狀，無法獲得澄清的提取液; 2%甲酸溶液和2%乙酸溶液用于各類樣品的前處理，效果較好，但考慮到甲酸的揮發性強于乙酸，最終決定采用2%乙酸溶液作為提取劑。樣品加入2.0%乙酸提取后，在低溫(4℃)下10 000 r/min離心5 min，可獲得較為澄清的提取液。

離心后的提取液中仍含有一定的蛋白質，由于采用了1.7 μm的小顆粒填料色譜柱，如不去除，可能造成色譜柱堵塞;另外親水性的HILIC色譜柱適宜于采用較高比例的有機相(乙腈)作為流動相，而提取液為100%水相，直接進樣導致色譜峰形不好?？紤]到上述因素，測定時移取0.5 ml提取液，加入乙腈混勻并定容至10 ml，因乙腈可促使蛋白質變性而沉淀，稍經放置過濾即可獲得澄清的溶液，過濾后直接用于超高效液相色譜-質譜/質譜測定，色譜峰形、靈敏度俱佳。

2.3 線性范圍和檢出限

將1.5中制備的基質加標樣品，按照本文處理方法制備系列標準溶液，所得各溶液中三聚氰胺濃度依次為:0.25、0.5、2.5、5、10、25 ng/ml，進樣測定后繪制標準曲線，回歸方程為Y=596.28X+341.62，相關系數優于0.995。

空白樣品中添加0.05 mg/kg三聚氰胺時，測定三聚氰胺定量離子對信噪比s/n大于20，因此確定該方法的檢出限為0.05 mg/kg。

2.4 方法的精密度和準確度

對一個陽性松花蛋樣品，重復測定6次，結果見表4，測定結果的相對標準偏差為2.92%，可見采用該方法測定禽蛋制品中三聚氰胺具有較好的精密度。

在不含三聚氰胺的雞蛋、鴨蛋、咸鴨蛋、松花蛋等樣品中分別添加0.05、0.1、1.0 mg/kg的三聚氰胺標樣，每個水平進行5次平行測定，平均回收率為89.4%～98.3%，相對標準偏差為3.35%～6.37%。