內生真菌球毛殼ND35的生物安全性評價

摘 要:本試驗初步研究了植物內生真菌球毛殼(Chaetomium globosum)ND35抗生物質粗提物對植物生長性狀和植物根際土壤微生物的影響，對小白鼠、大白兔的毒性，子囊孢子在水中的存活及對魚類的安全性。結果表明，球毛殼ND35抗生物質粗提物對黃瓜、菜豆和小麥的種子是安全的，并且能夠顯著增加須根數和根鮮重，促進種苗生長，對根際菌群數量無顯著影響，對動物來說屬低毒級;球毛殼ND35子囊孢子在水中能自行消解，且低于105cfu/ml時為泥鰍生長無顯著影響;表明球毛殼菌ND35無毒、無污染，用于土傳病害的生物防治無明顯性風險。

關鍵詞:植物內生真菌;球毛殼ND35;子囊孢子;生物安全性

中圖分類號:S476+.19文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2010)01-0071-05

Evaluation on Biological Security of Endophytic Fungus Chaetomium globosum ND35

GAO Jian-feng1， LI Xue1， LIU Shan-shan1， KONG Dan-dan1， ZHUANG Zhen-guo1， GAO Ke-xiang1*， LIU Yong-hong2

(1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018，China; 2.Demonstration Forestry Farm of Hebei Province， Yixian 074200，China)

Abstract The survival of the ascospores of Chaetomium globosum ND35 in water and its security to loach， and the effects of the crude extract of antibiotics from C. globosum ND35 on the rhizosphere microorganisms and growth of plant， as well as its toxicity to white mice and rabbits were studied in this experiment. The results showed that the crude extract was safe for cucumber， bean and wheat seeds， could significantly increase the number of fibrous roots and the fresh weight of radicle and promote the growth of seedlings; it had no significant impact on the number of the rhizosphere microorganisms， and it had low toxicity to animals. The ascospores could be digested spontaneously in the water， and when lower than 105 cfu/ml， it had no significant influence on loach. Therefore， C. globosum ND35 was non-toxic and non-polluting， and had no significant risk for biological control of soil-borne diseases.

Key words Endophytic fungus; Chaetomium globosum ND35; Ascospore; Biological security

毛殼菌(Chaetomium spp.)作為一類具有重要生防價值的生防菌，以其作用機制多樣性及防治病害的廣譜性而越來越受到關注[1，2]。球毛殼(Chaetomium globosum) ND35是一株分離自健康楊樹的內生真菌，具有廣譜的拮抗活性[3]。球毛殼ND35抗生素在植物病害生物防治中起重要作用，其抗生素的產生、提取純化及其在離體和溫室條件下的抑菌防病作用已有報道[4]。

球毛殼ND35作為活細胞制劑，以其對環境影響小以及在作用方式上不易使病原菌產生抗性等特點而得到認可，但大量球毛殼ND35施用后其安全性如何，球毛殼ND35作為生防菌施用后是否無毒、無污染、無殘留，對環境中其它有益微生物的影響如何，尚未見報道。 

本研究的目的在于通過對球毛殼ND35生物防治過程中可能遇到的對宿主作物生長的影響，對根際土壤中其它有益微生物的影響，對水資源安全性、魚苗生長等生態因子的影響以及對小白鼠、大白兔的毒性試驗，明確球毛殼ND35的生物安全性，以期為今后球毛殼ND35在生物防治中的安全應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試生防菌球毛殼 (Chaetomium globosum) ND35及其抗生物質粗提物均由山東農業大學植物病理系提供;供試菜豆品種為長白7號，番茄品種為新紅寶，黃瓜品種為津春4號，小麥品種為中優9507。

1.2 試驗方法

1.2.1 球毛殼菌ND35對寄主植物主要生育性狀的影響將黃瓜、菜豆和小麥種子用75%乙醇消毒30 s，放入1 mg/ml的球毛殼ND35粗提液浸泡1 h，于28℃室溫下催芽，以無菌水浸泡 1 h的種子作對照，待種子“露白”后播于滅菌的營養土里，每盆3株，同時用1 mg/ml的球毛殼ND35粗提液灌根處理，每盆20 ml。以無菌水灌根作對照，重復3次，待幼苗生長2周后，拔出植株，流水沖掉根部土壤，測量植株的生長指標。

1.2.2 球毛殼菌ND35對土壤中主要微生物類群的影響

精選飽滿且大小均一的菜豆、黃瓜和番茄種子，經溫湯催芽后播種于裝有田間營養土的花盆內，用1 mg/ml球毛殼菌ND35粗提液進行灌根處理，設空白對照，每處理重復3次。播種后30天，分別取菜豆、黃瓜和番茄根際土壤，稀釋105、104、103倍，分別吸取1 ml涂抹在NA、加入硫酸鏈霉素的PDA及高氏1號培養基平板上，26～29℃培養3～5天，調查菌落數。

1.2.3 球毛殼菌ND35子囊孢子在水中的活性和降解

分別取泰安市泰山區渿河水、泰山龍潭水庫水、泰安郊區大津口水庫水及自來水各200 ml，放入三角瓶中，分別加入球毛殼ND35子囊孢子，使水中子囊孢子的濃度為106 cfu/ml，每處理重復3次。在26℃下于往復式搖床上緩慢振動培養，每隔3天取樣一次，在光學顯微鏡下檢測子囊孢子的存活數。

1.2.4 球毛殼菌ND35對魚類的安全性試驗將事先存放1天的自來水，分別接種球毛殼菌ND35子囊孢子，使水中的孢子濃度分別為105 cfu/ml和106 cfu/ml，每盆加入6～7 cm長的泥鰍20條，以清水為對照，每3天換水一次，24～26℃室溫下培養，以20天為一個生長周期，2天后開始記錄魚苗死亡數，之后定期進行觀察并做好記錄。

1.2.5 球毛殼菌ND35抗生物質粗提物的毒性檢測試驗急性經口毒性試驗:以急性毒性試驗公認的首選動物小白鼠為試驗動物，以球毛殼菌ND35的抗生物質粗提物為試驗樣品，按Hom氏方法設計了20、40 mg/只的劑量，每處理雌雄各2只。將合適劑量的樣品與饅頭屑混合，給藥前供試動物絕食16 h，雌雄動物分別進行，染毒后持續觀察14天，記錄動物中毒癥狀和死亡時間(小白鼠平均每只體重20 g)。急性經皮毒性試驗:以大白兔為試驗動物，以球毛殼菌ND35的抗生物質粗提物為試驗樣品，按Hom氏方法設計了20、40 mg/只的劑量，每處理雌雄各1只，染毒方法為在動物背部用電推去除背毛，形成面積約5 cm×6 cm的脫毛區，將所設劑量的樣品均勻涂于4 cm×5 cm的紗布上，然后貼于脫毛區的皮膚上，外面覆蓋一層聚乙烯薄膜，用膠布固定。4 h后去掉覆蓋物，以溫水洗凈藥物，染毒后持續觀察14天，記錄動物中毒癥狀和死亡時間。

兔眼單次刺激試驗:大白兔雌雄各2只，以球毛殼菌ND35的抗生物質粗提物為試驗樣品，染毒方式為輕拉動物左眼眼瞼，將20、40 mg樣品分別倒入一只大白兔結膜囊內，輕輕閉合眼瞼約1 min，以動物自身對側右眼為對照，給藥后持續觀察14天進行刺激反應評分。

2 結果與分析

2.1 球毛殼菌ND35對宿主植物主要生育性狀的影響

試驗結果表明，1 mg/ml的球毛殼菌ND35抗生物質的粗提液對雙子葉的黃瓜、菜豆和單子葉的小麥種子的萌發沒有抑制作用;對胚根生長有顯著促進作用，可使根鮮重增加，且有促進根生長的作用，能使須根數增多;對黃瓜株高等地上部生長性狀也有明顯促進作用，黃瓜幼苗健康無病，葉片大、葉色綠(表1和 圖1)。

表1 球毛殼菌ND35粗提液對植物的促生長作用

植物種類根長(cm)地上部莖高(cm)莖和葉重量(g/株)根重(g/株)須根數(個)

黃瓜 對照9.20±3.0516.33±2.561.24±0.310.05±0.029.94±2.27

黃瓜 處理11.37±4.6815.45±1.651.32±0.380.06±0.0112.56±3.27

菜豆 對照22.15±3.4145.41±7.293.74±0.301.04±0.619.83±1.20

菜豆 處理22.56±3.9455.91±10.921.84±0.963.41±0.419.63±1.36

小麥 對照17.42±7.9136.18±0.893.36±0.450.11±0.065.13±0.04

小麥 處理16.86±5.135.56±0.513.97±0.370.07±0.015.44±0.03

A1、B1分別是用球毛殼菌ND35抗生物質粗提取液

處理的菜豆、黃瓜;A2、B2分別是用清水處理的菜豆、黃瓜

圖1 球毛殼菌ND35抗生物質粗提液 對植物的促生長作用

2.2 球毛殼菌ND35對土壤中主要微生物類群的影響

球毛殼ND35活菌制劑對番茄、黃瓜和菜豆根際土壤真菌總量的增加有一定作用，但與對照相比差異不顯著;球毛殼菌ND35活菌劑對番茄和菜豆根際土壤細菌的總量基本無影響，對黃瓜根際土壤細菌總量的增加有一定作用，而有益細菌含量的提高對改善土壤的理化性狀，提高土壤肥力具有重要意義;球毛殼ND35活菌劑對番茄和菜豆根際土壤放線菌的總量有一定抑制作用，但與對照相比差異不顯著;而球毛殼ND35活菌劑在高濃度時對黃瓜根際土壤放線菌的總量有一定抑制作用，可能是球毛殼ND35活菌制劑中加入了對土壤放線菌的抑制性微量元素有關(表2)。

2.3 球毛殼菌ND35對水資源安全性的影響

試驗結果表明:球毛殼菌ND35子囊孢子在河水、水庫水及自來水中均不能萌發，接菌后1天，各類水中的子囊孢子數量之間差異不顯著，隨著放置時間的延長，存活孢子量有所差異。其中自來水中存活的孢子量與其它水中相比差異顯著，存活時間也較長，河水中的存活時間最短，子囊孢子在接菌后第3天數量開始下降，第14天即檢測不到子囊孢子，其降解速度依次為河水>水庫水>自來水。子囊孢子在各種水中不能萌發，在河水中的降解速度最快，子囊孢子自行消解，因

表2球毛殼菌ND35對番茄等根際土壤中主要微生物類群的影響(菌落:個)

種類稀釋對照真菌處理真菌對照細菌處理細菌對照放線菌處理放線菌

番茄1230.33±0.051.67±0.657.67±1.511.00±0.535.00±0.266.67±2.085.33±1.5299±24.84265.33±12.856.67±0.5730.33±4.04260.23±9.64002.33±0.63004.33±1.51

黃瓜1232.00±1.002.67±1.153.33±1.071.00±0.786.67±2.0310.66±0.1917.33±4.3488.00±14.44217.33±41.9133.67±4.5097.33±13.22388.00±24.331.00±0.444.67±1.764.00±1.3200.55±0.230.33±0.12

菜豆12319.33±4.0419.00±4.7830.67±12.1226.33±3.7529.67±5.7641.00±5.5864.33±10.2190.67±11.08103.67±24.3178.00±4.0586.33±8.6489.00±6.9145.33±10.5340.33±10.7456.00±8.3245.00±14.1349.33±12.1553.67±8.07

注:1、2、3分別代表根際土壤被稀釋了105倍，104倍和103倍。

此不會造成水污染(圖2)。

2.4 球毛殼菌ND35對泥鰍安全性的影響

試驗結果表明:球毛殼菌ND35兩個濃度處理及對照均在室內飼養第3天達到死亡高峰，可能是泥鰍對新的生長環境不適應的一種反應。隨

后幾天死亡率進入平穩期，表現為無規律的零星自然死亡。處理20天的結果顯示，105 cfu/ml球毛殼菌ND35孢子懸浮液對泥鰍的存活率無顯著差異，且在此濃度下泥鰍長勢良好，體長較對照長，體色較對照黑。但是在106 cfu/ml球毛殼菌ND35孢子懸浮液中泥鰍全部死亡，即在106 cfu/ml或更高濃度下對泥鰍不安全(表3)。

2.5 球毛殼菌ND35的毒性檢測結果

小白鼠急性經口毒性試驗結果表明:所有動物染毒后無明顯中毒癥狀，亦未出現死亡，半致死劑量(LD50)雄性和雌性小白鼠均大于2 000 mg/kg，表明球毛殼菌ND35急性經口毒性為“低毒”級。

圖2 球毛殼菌ND35的子囊孢子在水中的降解

表3 球毛殼菌ND35的孢子對泥鰍存活率的影響

處理天數存活率(%)

清水對照105cfu/ml孢子懸浮液

12020

31818

61817

91816

121716

151716

急性皮膚單次刺激試驗結果表明:動物皮膚連續刺激14天積分為0，表明球毛殼菌ND35對兔皮膚單次刺激強度為“無刺激性”;急性兔眼單次刺激試驗結果表明:所有動物給藥后1 h 均未出現結膜沖血及水腫，眼連續刺激14天積分為0，表明球毛殼菌ND35對兔眼刺激強度分級為“無刺激性”。

3 討論與結論

由于過度使用化學農藥引起了一系列環境與社會問題，使用農用抗生素代替化學農藥防治植物病害是今后發展的方向之一[5]。所以農用抗生素的生物安全性問題也顯得尤為重要，生物安全性問題也是球毛殼ND35作為微生物農藥在研究和使用過程中不能回避的問題。一種微生物通過人為接種的方式被引入土壤中，可能通過對生態位點和營養及空間的競爭使一種甚至多種土壤中自然存在的微生物減少，從而破壞了土壤中原有的微生態環境。莊敬華等(2006)[6]對木霉菌(Trichoderma sp.)的生物安全性進行了檢測，試驗表明，與其它微生物農藥一樣木霉菌無毒、無污染，用于作物土傳病害的生物防治無明顯性風險。劉家發等(1999)[7]曾對幾種主要微生物農藥品種蘇云金桿菌、增產菌、白僵菌及幾種多角體病毒進行過系統的安全性試驗，結果表明所試微生物農藥是安全的，無毒、無污染。單純的微生物農藥沒有急、慢性毒性。

毛殼菌應用在果樹蔬菜生產中防治各種真菌病害已有報道[8，9]，但其對宿主植物和周圍環境的影響報道不多。本試驗對分離自健康植物的內生真菌球毛殼菌ND35進行了生物安全性的初步評價，試驗結果表明:球毛殼ND35對黃瓜、菜豆和小麥種子萌發、出苗沒有影響，對黃瓜、菜豆和小麥根系生長和株高還有明顯的促進作用;球毛殼ND35對番茄、黃瓜和菜豆根際的真菌、細菌及放線菌等微生物的正常生長沒有明顯影響;球毛殼ND35子囊孢子在河水、水庫水及自來水中均不能萌發，且子囊孢子經14～20天，菌體自行消解，當濃度小于或等于105 cfu/ml的球毛殼ND35孢子進入河水中，不會對魚類的生長造成影響;球毛殼ND35孢子制劑對小白鼠急性經口毒性屬于“低毒”級;急性經皮膚單次刺激試驗和經兔眼單次刺激試驗結果均表明為“無刺激性”。可以推斷，球毛殼ND35作為活體微生物制劑，與其它微生物農藥一樣無毒、無污染、無殘毒，不傷害土壤中其它有益微生物，不影響土壤和環境中微生態循環，用于設施蔬菜及陸地等作物土傳病害的生物防治無明顯性風險。這為今后將球毛殼ND35菌株開發成為實用的生防產品，深入研究其生物安全性和投放環境后的風險評估奠定了基礎。

參 考 文 獻:

[1] Shittu H O， Castroverde D C M， Nazar R N， et al. Plant-endophyte interplay protects tomato against a virulent Verticillium[J]. Planta， 2009， 229: 415-426.

[2] 遲玉杰，楊 謙. 毛殼菌對植物病害的生物防治及存在的問題[J]. 農業系統科學與綜合研究，2002， 18(3): 215-218.

[3] 劉曉光，高克祥，谷建才，等. 毛白楊內生菌優勢種毛殼ND35室內拮抗作用的研究[J]. 林業科學，1999， 35(5): 57-61.

[4] 萬 慧，劉曉光，曹榮花，等. 螺旋毛殼ND35抗生素的產生及其在病害生物防治中的作用[J]. 植物保護學報，2007， 34(1): 51-56.

[5] 朱昌雄，白新盛，張 木. 生物農藥的發展現狀及前景展望[J].上海環境科學，2002， 21(11):654-661.

[6] 莊敬華，陳 捷，楊長成，等.生防木霉菌生物安全性評價[J].中國農業科學，2006， 39 (4): 715-720.