棉花T-DNA標簽雄性不育突變體的遺傳分析

摘 要:利用農桿菌介導T-DNA插入得到棉花雄性不育突變體，與野生型陸地棉(Gossypium hirsutum L.)Coker312雜交得到F1代。F1代植株出現了不育與可育兩種性狀的分離，分離比是1∶1。對F1代進行形態學觀察、卡那霉素和除草劑抗性鑒定、PCR擴增檢測以及遺傳學分析，證實雄性不育突變性狀的表現與T-DNA插入共分離，從而認為突變是由T-DNA插入引起的顯性雜合突變，這為利用T-DNA標簽法進行雄性不育有關基因的克隆奠定了基礎。

關鍵詞:棉花;T-DNA;雄性不育突變體;遺傳分析

中圖分類號:S562.035.3文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2010)01-0022-04

Genetic Analysis of Cotton Male Sterile Mutant by T-DNA Tagging

ZHANG YU-qin1，2， GAO Jun-ping2， ZHANG Jin3，WANG Fu-rong2，ZHANG Jun2

(1.College of Life Science， Shandong Normal University， Jinan 250014，China;2.Shandong Subcenter of National Cotton Genetic Improvement Center of P.R.China/Shandong Cotton Research Center， Jinan 250100，China;3.College of Life Science， Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)

Abstract A male sterile mutant by T-DNA insertion was crossed with a wild type upland cotton (Gossypium hirsutum L.) cultivar Coker312.The segregation ratio of male sterile to male fertile was 1∶1 in generation F1.The results of morphological observation， kanamycin and herbicide resistance assay， PCR identification and corresponding genetic analysis showed that the male sterile was co-segregated with the T-DNA insertion.This male sterile mutant was considered as dominant heterozygous mutation caused by the T-DNA insertion，which would lay the basis for cloning the male sterile related genes of upland cotton by T-DNA tagging.

Key wordsUpland cotton;T-DNA;Male sterile mutant;Genetic analysis

在植物的基因克隆和功能分析研究中有許多種策略，利用突變體就是其中之一[1]。產生突變體的方法主要有理化誘變、T-DNA 插入、轉座子插入等[2]。其中，農桿菌介導的T-DNA標簽法[3]是目前研究植物功能基因組最有效、使用最廣泛的手段，據統計有40%的擬南芥突變基因是用T-DNA標簽法克隆的[4]。對這些基因的功能研究和利用將為提高作物的產量、品質、抗逆性提供更有效的途徑。

棉花是世界上重要的經濟作物，提高皮棉產量和纖維品質具有重要的經濟效益。目前利用不同品種間的雜交優勢是提高皮棉產量和纖維品質的主要手段。但大面積推廣的組合，仍然以人工去雄授粉為主，制種成本過高已經成為棉花雜種優勢利用的主要限制因素[5]。因此，利用基因工程手段克隆育性相關基因并加以利用創造理想的雄性不育系，就成為提高棉花產量和品質的新途徑。

本研究利用野生型Coker312花粉與根癌農桿菌介導T-DNA插入得到的T0代轉基因棉花雄性不育突變體雜交，獲得F1代植株。在對F1代植株進行育性觀察、卡那霉素和除草劑抗性鑒定、PCR擴增檢測的基礎上，對突變體進行遺傳分析，為下一步利用T-DNA標簽法[6]克隆與棉花雄性不育相關的基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生型陸地棉(Gossypium hirsutum L.)品系Coker312，T-DNA 插入得到的雄性不育突變體T0代植株。

1.2 育性鑒定

將雄性不育突變體與野生型Coker312雜交得到的F1代以及F1代不育株與Coker312雜交得到的F2代，種植于溫室和臨清試驗田，以野生型Coker312為對照，進行表型觀察和數據統計分析。

1.3 卡那霉素和除草劑抗性鑒定

將脫脂棉撕成小條蘸取500 mg/L的卡那霉素溶液涂抹棉花葉片，5 d后統計抗性植株和非抗性植株比例[7]。同樣用脫脂棉條蘸取1%的草甘膦溶液涂抹棉花葉片，統計抗性植株和非抗性植株比例。

1.4 轉基因棉花的分子鑒定

按照王芙蓉等[8]改進的CTAB法從棉花葉片中提取總DNA，參照T-DNA上含有的抗草甘膦基因和NPTⅡ基因設計引物，進行抗草甘膦基因和NPTⅡ基因PCR擴增。引物序列見表1。

表1 用于擴增T-DNA上特異片段的PCR引物序列

引物名稱引物序列( 5'-3')

GR-fTTTACAAGTGGCCACCTAGCT

GR-rTGGTTCGTGTCTCATGCACTT

NPTII-fCCTGTCCGGTGCCCTGAATGAAC

NPTII-rCCACACCCAGCCGGCCACAGTCG

2 結果與分析

2.1 雄性不育突變體性狀表現

從T-DNA插入株系中獲得了一個突變體，該突變體葉片和株高發育正常，但花絲短，柱頭較長，花藥不開裂，不能正常散粉，進行自交后不結鈴。利用Coker312花粉進行人工授粉后結鈴并獲得種子，說明該突變體柱頭發育正常，雄蕊發育異常，屬于雄性不育突變體(圖1)。對該突變體進行全生育期的觀察，雄性不育突變表型在生長發育過程中表現穩定。

A為突變體雄性不育花;B為野生型正常花

圖1 T-DNA插入突變體雄性不育表型

2.2 遺傳分析

將突變體與野生型Coker312雜交得到的F1代種植于溫室和臨清試驗田，以野生型Coker312為對照，進行表型分析。F1代共41株，19株表現為雄性不育，22株可育，符合1∶1的分離假設(χ2C = 0.220 < χ20.05 = 3.84)，據此我們認為該突變類似于顯性突變。為驗證突變性狀的穩定性，將F1代分離出的不育株再授以Coker312的花粉，得到F2代植株共185株，有90株表現雄性不育，95株可育，分離比仍然是1∶1(χ2C = 0.135 < χ20.05 = 3.84)，結果與F1代完全一致，進一步證明該突變是顯性雜合突變。

2.3 卡那霉素和除草劑抗性鑒定

由于T-DNA區含有抗草甘膦基因和NPTⅡ基因(圖2)，對卡那霉素和除草劑有抗性，因此可對F1代進行抗性鑒定。用500 mg/L的卡那霉素溶液涂抹F1代棉花葉片，處理5 d后F1代中19株雄性不育棉花的葉片沒有任何斑點，正常生長，顯示出明顯的抗性;22株可育棉花的葉片處理部位出現黃斑、萎縮。除草劑抗性的表現與卡那霉素鑒定的結果一致。從而證實，突變體植株具有明顯的野生型植株所不具備的抗性，卡那霉素和除草劑抗性表現與育性表型一致，表明雄性不育

注:水平箭頭示引物的位置

圖2 插入到棉花基因組中的T-DNA結構

突變性狀與卡那霉素和除草劑抗性基因共分離。

2.4 轉基因棉花的分子鑒定

為了從分子水平上驗證突變是否與T-DNA插入有關，對F1代中的41株進行抗草甘膦基因和NPTⅡ基因的PCR擴增。利用引物GR-f、GR-r擴增抗草甘膦基因(圖3上圖);利用引物NPTⅡ-f和NPTⅡ-r擴增NPTⅡ基因(圖3下圖)。結果表明F1代中，19株不育植株能擴增出一條抗草甘膦的1 199 bp片段和一條NPTⅡ的488 bp片段(圖的第1、4泳道);而育性正常的22株植株(如泳道2、3、5)中均無特異性的擴增條帶出現。即基因組DNA的PCR擴增結果、卡那霉素和除草劑鑒定結果與棉花育性表型具有一致性。表現為:轉基因F1代棉花中有19株雄性不育棉花同時具有卡那霉素和除草劑抗性，并可擴增出抗草甘膦基因和NPTⅡ基因的特異性片段;22株育性正常棉花不具有卡那霉素和除草劑抗性，也無特異性條帶擴增。這也表明雄性不育突變性狀與抗草甘膦基因和NPTⅡ基因共分離，即雄性不育突變性狀與T-DNA的插入相關，提示該突變體可能含有單個T-DNA插入位點且與T-DNA共分離，因此可以通過T-DNA標簽法分離突變基因。為了進一步驗證，利用研究得到的T-DNA插入位點的基因組序列設計引物組合，擴增突變體基因組和野生型基因組。如果突變體是純合體，由于T-DNA的間隔，PCR就不會有

圖3 棉花基因組中T-DNA上的抗草甘膦基因(上圖) 和NPTII基因(下圖)的PCR擴增

擴增產物。結果突變體和野生型得到了相同的擴增結果(結果未顯示)，并且巢式引物也說明了反應產物是特異性產物，充分說明F1代突變體為雜合體，突變為顯性突變。因而，從分子水平證實該突變是顯性雜合突變。

3 討論與結論

突變體是遺傳學研究的基本材料，在植物的基因克隆和功能分析研究中有重要作用。T-DNA標簽法是研究植物功能基因組最有效、使用最廣泛的人工誘導產生突變體的手段，其優點是一旦確定突變性狀由T-DNA插入引起， 就可以通過測定T-DNA的旁側序列而快速分離到相應的突變基因[6]。目前利用不同棉花品種間的雜交優勢是實現這一目標的主要手段。但人工去雄、授粉創造雜交組合使得制種成本過高，已成為限制雜種優勢利用的主要因素。雖然已從棉花中鑒定出了一些不同類型的雄性不育系，但一直難以在雜交制種中應用[5]。因此，可以利用T-DNA標簽法克隆育性相關的基因，研究雄性不育的分子機理，并加以利用，創造理想的棉花雄性不育系類型。

本研究利用T-DNA插入得到雄性不育的T0代突變體，用野生型Coker312花粉與之雜交獲得F1代植株。F1代以及F2代植株均出現1∶1的育性分離，與卡那霉素和除草劑抗性鑒定以及PCR檢測結果一致，進一步的分子鑒定結果證實突變是由T-DNA插入引起的顯性雜合突變，因此可以通過測定T-DNA的旁側序列而快速分離到相應的突變基因。大多數情況下，雄性不育表型是純合的隱性基因(ms/ms)造成的，雜合(+/ms)具有正常的花粉。該基因座位可能蘊含了一種新的雄性不育的遺傳機制。對該位點及其附近基因的克隆，及其在棉花生殖發育中的功能研究，將有助于更好地了解棉花的生殖發育，為棉花雄性不育機理研究奠定基礎，進而可能成為促進雜種優勢利用，提高棉花產量和品質的新途徑。

參 考 文 獻:

[1] Richards S J， Hill A，Hillmen P.Recent advances in the diagnosis， monitoring and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J].Cytometry B.Clin.Cytom.， 2007，