二苯乙烯苷對SAMP8鼠腦組織膽堿能及單胺類神經遞質的影響

【摘要】 目的 觀察二苯乙烯苷(TSG)對SAMP8鼠腦組織膽堿能神經遞質及單胺類神經遞質含量的影響。方法 選用6月齡的SAMP8鼠50只，隨機分為5組，SAMP8對照組、陽性藥石杉堿甲對照組、TSG低、中、高劑量組，每組10只。另選用6月齡SAMR1鼠10只作正常對照組。各組分別灌胃相應藥物50天后，采用分光光度法檢測各組小鼠腦組織膽堿乙酰轉移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AchE)活性，高效液相色譜法檢測各組小鼠腦組織去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羥色胺(5HT)含量。結果 SAMP8對照組腦組織ChAT活性明顯降低，AchE活性明顯升高，NE、DA、5HT的含量明顯降低，與正常對照組比較有顯著性差異(P<0.05或0.01);TSG中、高劑量組ChAT活性顯著升高，TSG各劑量組AchE活性顯著降低(P<0.05或0.01)，NE、DA、5HT含量均得到提高，與SAMP8對照組比較，差異具有顯著性(P<0.05或0.01)。結論二苯乙烯苷可有效促進乙酰膽堿(Ach)的合成及減少乙酰膽堿的分解，促進單胺類神經遞質的合成，具有良好的抗癡呆的作用。

【關鍵詞】 二苯乙烯苷;老年性癡呆;膽堿能神經遞質;單胺類神經遞質

文章編號:1003-1383(2010)04-0381-03 中圖分類號:R963文獻標識碼:A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.04.001

阿爾茨海默病，即老年性癡呆(alzheimer eisease，AD)是危害老年人身心健康的常見病、多發病。目前該病的發病機制尚未明確，研究發現AD與腦內多種神經遞質密切相關[1，2]。二苯乙烯苷(2，3，5，4'四羥基二苯乙烯βD葡萄糖苷，TSG)是何首烏中的主要水溶性成分，近年來發現其具有神經保護作用，對老年性癡呆的防治具有很好的應用價值[3，4]。本實驗從何首烏提取TSG成分，以SAMP8(senescence accelerated mouse prone/8，快速老化小白鼠)為老年性癡呆動物模型，考察二苯乙烯苷對SAMP8鼠腦組織膽堿能及單胺類神經遞質的影響，報道如下。

材料和方法

1.動物 SAMP8和SAMR1(senescence acceleratedresistant mouse/1， 正常老化小白鼠)雄性小鼠由天津中醫學院第一附屬醫院提供(實驗動物質量合格證號:WJ津實動質M準字第006號)，SPF級，體重24～28 g。

2.主要試劑 ChAT(膽堿乙酰轉移酶)、AchE(乙酰膽堿酯酶)、T.P(總蛋白)測試盒由南京建成生物工程研究所提供。標準品:去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羥色胺(5HT)標準品(Sigma公司生產);流動相:甲醇、乙腈(天津市四友精細化學有限公司生產，批號:Q/SHIELD0022000);磷酸氫二鈉(廣東合山化工廠生產，批號:20060801);樣品前處理試劑:高氯酸(廣東愛廉化試劑有限公司生產，批號:060508);陽性對照藥:石杉堿甲(豫中制藥廠生產，批號:H10940156);二苯乙烯苷(由右江民族醫學院生化教研室根據有關文獻[5，6]提取，純度為73%)。

3.實驗儀器 TU1800 SPC紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);RA50半自動化分析儀(Bayer Diagnostics Mfg. Ltd);FJ200高速分散勻質機(上海標本模型廠);Waters1525高效液相熒光檢測器(美國Waters公司);C18(4.6×250mm，5μm)色譜柱(Agilent公司);高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

4.方法

(1)動物分組與給藥 選擇6月齡SAMP8雄性鼠50只，隨機分為SAMP8對照組、陽性藥石杉堿甲對照組、TSG低劑量組、TSG中劑量組、TSG高劑量組，每組10只。另外選擇6月齡SAMR1雄性鼠10只，作為SAMRl對照組。各組均按0.2 ml/10 g體重給藥。SAMP8對照組、SAMRl對照組:生理鹽水，30ml#8226;kg-1;陽性藥對照組:石杉堿甲0.02 mg#8226;kg-1;TSG低劑量組:TSG 0.033 g#8226;kg-1;TSG中劑量組:TSG 0.1 g#8226;kg-1;TSG高劑量:TSG 0.3 g#8226;kg-1。以上各組每日灌胃給藥l次，連續50天。

(2)標本采集 第50天給藥1小時后處死小鼠，同時迅速剝離小鼠腦組織于4℃預冷的生理鹽水漂洗除去血液，用濾紙吸干多余水分，分離左右半腦并分別稱重，左半腦用于ChAT、AchE、T.P測定，右半腦用于NE、DA、5HT測定。

(3)ChAT、AchE、T.P的測定 分取出各組小鼠左半腦，分別加入9倍體積的冰生理鹽水，用高速分散勻質機制成10%的腦勻漿，3000 r#8226;min-1離心10 min，取上清液待測。按試劑盒操作說明分別對各組小鼠腦勻漿上清液進行ChAT、AchE、T.P測定。各組小鼠ChAT、AchE活性除以相應的T.P含量作為ChAT、AchE的單位。

(4)單胺類神經遞質標準曲線的制備 精密稱取NE、DA、5HT標準樣品各0.01 mg，分別用流動相定容于5 ml容量瓶中，制成0.002 g#8226;L1的NE、DA、5HT的貯存液。按需要稀釋成各種濃度進樣，每次進樣20 μl，以進樣濃度(X，μg#8226;L-1)對峰面積(Y)進行線性回歸。

(5)單胺類神經遞質測定方法 取出各組小鼠右半腦，分別加入9倍量(重量/體積比)5%HClO4，超聲粉碎成10%勻漿，冷凍高速離心14000 r#8226;min-1 15分鐘，取上清液進樣20 μl。記錄各樣品的峰面積，代入相應標準曲線計算出相應濃度，統計結果。色譜條件:色譜柱為Waters symmetry C18(4.6×250mm，5μm);流動相A:磷酸鹽緩沖液;流動相B:甲醇;時間與流速:0～10 min 0.5 ml#8226;min-1，10～14 min1.0ml#8226;min-1，14～22.5 min 1.5 ml#8226;min-1，22.5～30 min 0.5 ml#8226;min-1;A和B泵的比例:90∶10;AUFS:0.01;波長:激發波長254 nm，發射波長338 nm;柱溫:35℃。

5.統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件包統計分析，計量資料以均數±標準差(-±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.二苯乙烯苷對ChAT和AchE活性的影響 與SAMR1對照組相比，SAMP8對照組ChAT活性明顯降低，AchE活性明顯升高(P<0.05)。與SAMP8對照組相比，TSG中、高劑量組ChAT活性顯著升高，TSG各劑量組AchE活性顯著降低(P<0.05或0.01)。與陽性藥對照組比較，TSG各劑量組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.NE、DA、5HT含量的標準曲線制備 根據標準曲線求得其回歸方程為:Y=515.6X-38171.9，Y=329.3X-34557.2和Y=342.4X+534.5;線性范圍分別125～2000 μg#8226;L-1，125～4000 μg#8226;L-1和10～500 μg#8226;L-1。

3.二苯乙烯苷對三種單胺類神經遞質含量的影響 與SAMR1對照組和陽性藥對照組相比，SAMP8對照組動物NE、DA、5HT含量水平明顯下降(P<0.05或0.01)。與SAMP8對照組相比，二苯乙烯苷各劑量組能明顯升高NE、DA、5HT水平(P<0.05或0.01)，其中以高劑量組作用更明顯(P<0.01)。見表2。

討論

AD是一種以認知功能下降為特征的神經退行性病變，累及多種神經遞質系統，其中膽堿能系統活性下降是引起AD癡呆表現的重要原因之一 。研究表明，AD腦內隔區、Meynert基底核等部位的膽堿能神經元明顯減少，AD患者腦內乙酰膽堿(Ach)合成分泌減少，其合成酶ChAT活性下降，且與癡呆嚴重程度密切相關[7，8]。AchE是催化Ach水解的主要生物酶，研究證實AD腦內一方面正常神經元內AchE活性降低，另一方面，神經纖維纏結(NFT)和老年斑(SP)內游離于神經元外的AchE活性顯著提高，它們可大量水解Ach，使皮質Ach活性進一步降低[9]。而腦內Ach含量降低，AchE活性升高，M和N膽堿受體數量減少均可能造成認知功能障礙。

認知機制不僅與膽堿能神經系統密切相關，而且與單胺類神經遞質NE、DA、5HT密切相關。正常情況下，中樞內神經遞質的分泌保持在一定水平，它們之間相互制約處于一種平衡狀態，從而維持功能的穩定[10]。研究表明，腦內單胺類神經遞質NE、DA、5HT等在學習記憶等方面具有重要作用，NE主要在記憶保持方面起作用，而改善記憶與促進DA釋放有關，5HT系統則參與調節情緒、動機和食欲等[11]。隨著機體的老化，會出現學習記憶能力的下降，同時腦內單胺類神經遞質的代謝亦發生紊亂，導致NE、DA、5HT含量的下降，出現癡呆和憂郁等癥狀[12]，而改善中樞單胺類神經遞質的代謝可彌補或扭轉學習記憶的障礙[13]。

本組實驗結果顯示，與SAMR1對照組相比，SAMP8對照組ChAT活性明顯降低，AchE活性明顯升高，單胺類神經遞質NE、DA、5HT的含量均明顯下降。而經二苯乙烯苷治療后，TSG各劑量組的ChAT活性明顯升高，AchE活性明顯降低， NE、DA、5HT的含量均明顯提高。提示二苯乙烯苷可促進Ach合成，減少Ach分解，并有效調整中樞單胺類神經遞質的合成，通過影響中樞膽堿能神經系統和單胺類神經遞質的功能而發揮抗癡呆作用。

參考文獻

[1]Van der Cammen TJ，Tiemeier H，Engelhart MJ，et al.Abnormal neurotransmitter metabolite levels in Alzheimer patients with a delirium[J].Int J Geriatr Psychiatry， 2006，21(9):838-843.

[2]Smith GS，Kramer E，Ma Y，et al.Cholinergic modulation of the cerebral metabolic response to citalopram in Alzheimer's disease[J].Brain，2009，132(pt2):392-401.

[3]王春英.何首烏中有效成分二苯乙烯苷的研究進展[J].河北醫科大學學報，2008，29(1):157-160.

[4]賈 新，陳建宗.二苯乙烯苷神經保護作用及其機制的研究進展[J].國際中醫中藥雜志，2007，29(6):347-348.

[5]朱海升，蔡光明，劉鄂湖，等.大孔吸附樹脂分離純化何首烏有效成分二苯乙烯苷的研究[J].解放軍藥學學報，2006，22(4):269-273.

[6]江濤濤，歐陽臻，繆亞東，等.大孔樹脂吸附純化何首烏中二苯乙烯苷的研究[J].中國中藥雜志，2006，31(8):646-649.

[7]Day T，Greenfield SA.A peptide derived from acetylcholinesterase induces neuronal cell death: characterisation of possible mechanisms[J].Experimental Brain Research，2003，153(3):334-342.

[8]Grothe M，Zaborszky L，Atienza M，et al.Reduction of basal forebrain cholinergic system parallels cognitive impairment in patients at high risk of developing Alzheimer's disease[J].Cereb Cortex，2010，20(7):1685-1695.

[9]Haense C，Hohmann C，Kalbe E，et al.Regional cortical acetylcholine esterase activity in healthy controls， mild cognitive impairment and Alzheimer's disease[J].J. NUCL. Med，MEETING ABSTRACTS，May 2009，50:1258.

[10]Birthelmer A，Stemmelin J，Jackisch R，et al.Presynaptic modu1ation of acetylcholine， noradrenaline， and serotonin release in the hippocampus of aged rats with various levels of memory impairments[J].Brain Res Bull，2003，60(3):283-296.

[11]Nowakowska E，Chodera A，Kus K，et al.Reversal of stress induced memory changes by moc1obemide: the role of neurotransmitters[J].Pol J Pharmacol，2001，53(3):227-233.

[12]De la Fuente M，Hemanz A，Medina S，et al.Characterization of monoaminergic systems in brain regions of prematurely ageing mice[J].Neurochem Int，2003，43(2):165-172.

[13]江雪華，李 銳，周莉玲.腦力智寶對學習記憶障礙模型小鼠的保護作用[J].廣州中醫藥大學學報，2008，25(6):528-533.

(收稿日期:2010-06-18 修回日期:2010-07-20)

(編輯:梁明佩 英文審校:鐘京梓)