T系膜增生性腎炎與TCRCα基因+1592C/T多態(tài)性的病例對(duì)照關(guān)聯(lián)分析

【摘要】 目的 探討中國(guó)漢族人群系膜增生性腎炎與TCRCα基因+1592C/T多態(tài)性的相關(guān)關(guān)系。方法 用PCRRFLP法和PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法鑒定基因型，采用病例對(duì)照的方法。結(jié)果 280例患者中，TCRCα+1592C/T存在三種基因型，CC基因型為多見(jiàn)，CC∶CT∶TT=213∶65∶2，IgA腎病組與192例正常對(duì)照組相比較，不論是基因型還是等位基因，均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 中國(guó)漢族人群中，系膜增生性腎炎可能與TCRCα基因+1592C/T的遺傳易感性不相關(guān)，TCRCα基因+1592C/T可能不是系膜增生性腎炎的疾病傳遞不平衡連鎖基因堿基位點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 系膜增生性腎炎;TCRCα;相關(guān); 基因;多態(tài)性

文章編號(hào):1003-1383(2010)04-0391-02 中圖分類(lèi)號(hào):R 692.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.04.005

T細(xì)胞受體(Tcell receptor，TCR)和補(bǔ)體在T細(xì)胞活化和抗原識(shí)別中起作用。系膜增生性腎炎是各類(lèi)腎小球腎炎中最多見(jiàn)的病理類(lèi)型，炎癥與免疫是其主要病理生理機(jī)制。TCR基因由于直接相關(guān)最重要的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，是系膜增生性腎炎最重要候選基因之一。TCR保守域α鏈基因(TCRCα)編碼TCRα鏈近膜端保守域的氨基酸，位于14號(hào)染色體14q11～14q12。TCRCα+1592C/T 位于TCRCα 基因片段第一外顯子下游內(nèi)含子區(qū)域。近年遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究越來(lái)越表明，內(nèi)含子在選擇性剪接中扮演重要角色，一個(gè)基因可以因此而產(chǎn)生多種不同的蛋白質(zhì)[1]。TCRCα+1592C/T與系膜增生性腎炎遺傳易感性相關(guān)關(guān)系如何?此位點(diǎn)堿基變異的意義尚缺乏研究。為此，本研究采用病例對(duì)照研究的方法，探討中國(guó)漢族人群中，系膜增生性腎炎與TCRCα基因+1592C/T多態(tài)性的相關(guān)關(guān)系。為進(jìn)一步揭示TCRCα 在系膜增生性腎炎的遺傳學(xué)機(jī)制中的意義提供資料。

對(duì)象和方法

1.對(duì)象 280例行腎活檢為系膜增生性腎炎的原發(fā)腎小球腎炎的患者，均為我院1999～2009年收治的住院與門(mén)診患者，男163例，女117例，平均年齡(27.8±17.5)歲，均系漢族人。以192例本地區(qū)漢族健康正常獻(xiàn)血者，既往無(wú)腎臟病及其它系統(tǒng)性疾病病史的為正常對(duì)照組。診斷嚴(yán)格按WHO標(biāo)準(zhǔn)[2]，采集血樣。

2.基因組DNA提取 抽取外周抗凝血5 ml，采用QIAamp DNA kit抽提DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.TCRCα+1592C/T內(nèi)含子C/T基因型鑒定 PCR擴(kuò)增含有(內(nèi)含子C/T)單核苷酸多態(tài)性的TCRCα基因第一外顯子下游內(nèi)含子基因片段(chr14:2208739422088111)，長(zhǎng)718 bp。上游引物序列為5′TTCAAGCAGGGAAGGGACACC3′，下游引物序列為5′TCCAATGAGGCAGCGAGGCA3′(上海申友生物工程公司合成)。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性9 min，94 ℃變性35 s，57 ℃退火55 s，72 ℃延伸55 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體積為30 μl。 以SDU內(nèi)切(美國(guó)MBI公司)37 ℃消化PCR產(chǎn)物，20 g/L凝膠電泳分帶，確定基因型。

4.PCR產(chǎn)物直接測(cè)序 取PCR產(chǎn)物10例測(cè)序。方法

為:純化的DNA模板20 ng，BigDye terminator cycle sequen cing ready reaction kit mix 2 μl，測(cè)序引物(同PCR擴(kuò)增引物)10 pmol/μl組成8 μl反應(yīng)體系進(jìn)行測(cè)序PCR。反應(yīng)條件:98 ℃ 1 min，96 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，60 ℃ 4 min，25個(gè)循環(huán)。3 mol/L乙酸鈉(pH 5.2)和無(wú)水乙醇沉淀擴(kuò)增的DNA，再用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗滌1次，然后加入18 μl模板變性劑TSR(template suppression reagent)。測(cè)序模板在95 ℃水浴5 min，立即置于冰水中5 min將其淬滅成單鏈，轉(zhuǎn)移至測(cè)序管，在ABI3100 全自動(dòng)序列分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序[3]。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用HardyWeinberg平衡吻合度檢驗(yàn)對(duì)照組群體代表性;計(jì)數(shù)資料的比較采用χ²或秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.TCRCα+1592C/T基因型 TCRCα基因內(nèi)含子C/T多態(tài)性的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為718 bp，在擴(kuò)增片段上有內(nèi)含子C/T單核苷酸多態(tài)性，酶切后CC型為1條718片段(2、3、4、5、6、8、10)，TT型產(chǎn)生461 bp、257 bp兩條片段(1)，CT型則為718 bp、461 bp、257 bp 3條片段(7、9、11)。見(jiàn)圖1。該位點(diǎn)多態(tài)性經(jīng)抽樣測(cè)序鑒定，證實(shí)同電泳結(jié)果相同。

2.HardyWeinberg遺傳平衡符合程度的χ²檢驗(yàn) 經(jīng)檢驗(yàn)對(duì)照組TCRCα+1592C/T多態(tài)性的基因型頻率符合遺傳平衡定律(χ² = 1.74， P=0.19>0.05)，表明各基因頻率已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

3.兩組基因型、等位基因分布比較 不論是基因型還是等位基因，均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

討論

遺傳性因素在IgA腎病等以系膜增生為主的原發(fā)腎小球腎炎的病理發(fā)病機(jī)制中具有重要地位[4]。但其分子遺傳學(xué)機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。TCR基因位于人第14號(hào)染色體上，包括TCR可變區(qū)基因片段(V)、多樣性基因片段(D)、連接基因片段(J)和保守域基因片段(C)片段，不同亞型的TCR分布于CD4、CD8、CD25等各種T淋巴細(xì)胞表面。TCR基因各片段具有眾多的復(fù)雜的基因多態(tài)性。近年內(nèi)含子的基因性狀對(duì)遺傳效應(yīng)的貢獻(xiàn)得到重視[1]。

病例對(duì)照結(jié)果顯示:不論是基因型還是等位基因，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這提示TCRCα基因+1592C/T多態(tài)性可能與系膜增生性腎炎的遺傳易感性不相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族人群TCRCα基因575A/G多態(tài)性可能與腎炎系膜增生、肉眼血尿的發(fā)生相關(guān)[3]，TCRCα基因560C/T多態(tài)性可能與IgA腎病蛋白尿的發(fā)生及腎臟病理有一定關(guān)聯(lián)性[5];TCRCα基因575A/G及TCRCα基因560C/T多態(tài)性均找到一些與腎臟病相關(guān)的關(guān)系，但對(duì)TCRCα基因+1592C/T多態(tài)性位點(diǎn)的基因變異，目前國(guó)際上尚無(wú)其他種族人群的研究作參考。近年有人利用家族中傳遞不平衡檢驗(yàn)和單體型相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析的研究方法，進(jìn)一步證實(shí)了TCRCα基因多個(gè)單體型板塊均與我國(guó)漢族人IgA腎病的遺傳易感性密切相關(guān)，呈強(qiáng)連鎖不平衡關(guān)系[6]。這表明地域與種族差異可以對(duì)基因特征產(chǎn)生很大的影響，進(jìn)而對(duì)某種疾病可能起到遺傳學(xué)意義上的作用。但TCRCα基因+1592C/T多態(tài)性作為第一外顯子下游內(nèi)含子區(qū)域的多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)之一，一方面，作為內(nèi)含子，本身對(duì)基因的表型及轉(zhuǎn)錄起的作用可能比不上調(diào)控區(qū)及外顯子區(qū)大;另一方面，此位點(diǎn)的堿基變異，因發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒(méi)有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域，可能的確對(duì)整個(gè)穩(wěn)定區(qū)基因片段的總體特性沒(méi)什么大的影響。故推測(cè)TCRCα基因+1592C/T可能對(duì)TCRCα的轉(zhuǎn)錄、翻譯影響力弱，進(jìn)而不會(huì)與系膜增生性腎炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，廣西漢族人群中，系膜增生性腎炎的發(fā)病易感性可能和TCRCα基因+1592C/T基因型或等位基因無(wú)相關(guān)關(guān)系，TCRCα基因+1592C/T可能不是系膜增生性腎炎的疾病傳遞不平衡連鎖基因堿基位點(diǎn)。系膜增生性腎炎的臨床、病理表現(xiàn)形式多種多樣，而且TCRCα基因多態(tài)性位點(diǎn)眾多，哪些位點(diǎn)是疾病連鎖的重要堿基變異，仍需繼續(xù)研究探討。

參考文獻(xiàn)

[1]Gudikote JP， Wilkinson MF.Tcell receptor sequences that elicit strong downregulation of premature termination codonbearing transcripts[J].EMBO J，2002，21(1～2):125-134.

[2]Churg J，Bernstein J，Glassock RJ. Renal disease classification and atlas of glomerulardisease[M].Second edition.New York: Ikagu Shoin，1995:45-47.

[3]薛 超，李幼姬，李彩霞，等. 中國(guó)漢族人群TCRCα基因575A/G多態(tài)性與IgA腎病臨床病理相關(guān)分析[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(22):2079-2081.

[4]Maixnerová D， Merta M， Reiterová J， et al.The pathogenetic aspects and gene polymorphisms of IgA nephropathy[J].Prague Med Rep，2006，107(2):171-188.

[5]薛 超， 李幼姬，李彩霞，等. TCRCa560 C/T多態(tài)性與IgA腎病臨床病理的關(guān)聯(lián)分析[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005，26(10):897-900.

[6]Li R，Xue C，Li C，et al.TRAC variants associate with IgA nephropathy[J].J Am Soc Nephrol， 2009，20(6):1359-1367.

(收稿日期:2010-07-20 修回日期:2010-08-02)

(編輯:潘明志 英文審校:鐘京梓)