槲寄生堿對人肝癌細胞株SMMC-7721 bcl-2mRNA表達的影響

摘要：為研究槲寄生堿對人肝癌細胞株SMMC-7721對bcl-2mRNA表達的影響。采用半定量RT-PCR法測定bcl-2 mRNA表達變化。結果表明，RT-PCR檢測SMMC-7721細胞中bc1-2、mRNA表達的相對強度，發現bc1-2mRNA的表達強度降低(P<0.05)。說明中藥槲寄生堿抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖作用與降低bcl-2 mRNA表達水平有關。

關鍵詞：槲寄生堿；bcl-2 mRNA；RT-PCR；人肝癌細胞SMMC-7721

中圖分類號：R931.7文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2010.06.003

Effect of Mistletoe Alkali on Expression of bcl-2 mRNA in Human Hepatocarcinoma Cell SMMC-7721

KONG Fan-qing1， DING Hai-mai1，YANG Yan-hong2， GUO Mei-xiang2

(1.Baotou Medical College， Baotou， Neimenggu 014010， China; 2. The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Baotou， Neimenggu 014010，China)

Abstract：This study was designed to investigate the expression of bcl-2 mRNA in Human Hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 tread with mistletoe alkali in vitro. Change of bcl-2 mRNA expression in human Hepatocarcinoma cell SMMC-7721 was detected by Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Degression of bcl-2 mRNA expression(P<0.05) was detected by using RT-PC. Proliferation was inhibited by mistletoe alkali in SMMC-7721 cell line. Its mechanism was related to degression of bcl-2 mRNA expression.

Key words: mistletoe alkali; bcl-2 mRNA; reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR); human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721

槲寄生（Viscum coloratum(Kom.)Nakai）是一味傳統中藥，有祛風濕，補肝腎，強筋骨，養血、安胎等功效[1]。近年來，人們發現槲寄生有抗腫瘤作用，其抗腫瘤活性成分主要為槲寄生糖蛋白、毒肽、生物堿。對于槲寄生糖蛋白、毒肽的結構，抗腫瘤作用及機制的研究進展較快，歐洲槲寄生糖蛋白制劑已廣泛用于臨床并取得較好療效。但對于槲寄生堿抗腫瘤的研究較少，其抗腫瘤作用的機理尚未見報道。本實驗組已證實槲寄生堿對肝癌SMMC-7721細胞增殖有顯著抑制作用， 且呈劑量和時間依賴性[2]。本試驗選取濃度為0.1 mg·mL-1槲寄生堿液（抑制率為38%）作用于SMMC-7721細胞，觀察其對bcl-2mRNA表達的影響。

1材料和方法

1.1材料

主要試劑和儀器：一步法RT-PCR試劑盒（BBI），胎牛血清（杭州四季青公司），RPMI1640（GIBCO），Trizol試劑 、引物、瓊脂糖（上海生工），Forma CO2培養箱（美國），Enpddorf低溫離心機（德國），PCR儀(美國)，倒置顯微鏡、凝膠成像系統（上海康樂）。

藥物：槲寄生購于中藥房，經山西醫科大學藥學系揚官娥教授鑒定。槲寄生堿由包頭醫學院化學教研室提取。

細胞株：人肝癌SMMC-7721細胞株購于中國科學院上海細胞研究所。

1.2方法

1.2.1細胞體外培養細胞培養于含10%胎牛血清、100 mg·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI1640培養基中， 37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每2 d換液1次。

1.2.2RNA提取取對數生長期的SMMC- 7721細胞調整至2×105·mL-1，2.5 mL 接種于6孔板，置37 ℃、5 %CO2培養24 h后棄原培養液，加入含濃度為0.1 mg·mL-1槲寄生堿培養液2.5 mL培養24 h，按Trizol試劑所附說明提取RNA，紫外分光光度計檢測純度。引物用滅菌去離子水溶解成10 μmol·L-1。

1.2.3引物設計按參考文獻[3]、[4]及GenBank中基因序列設計引物如表1。

1.2.4 逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)按一步法逆轉錄試劑盒要求配成50 μL反應體系進行反應。逆轉錄條件：45 ℃30 min ，94 ℃滅活逆轉錄酶2 min。bcl-2擴增條件: 94 ℃30 s，45 ℃30 s，72 ℃1 min，35個循環，72 ℃ 延伸8 min；β-actin擴增條件: 94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環，72 ℃延伸8 min。

1.2.5半定量分析將擴增的RT-PCR 產物在1.5 %瓊脂糖凝膠、0.5 ×TBE 緩沖液中電泳檢測，電泳條件為90 V恒壓1 h。紫外透射儀下觀察電泳條帶，于凝膠成相儀上進行目的條帶的光密度定量，bcl-2mRNA表達相對強度= bcl-2條帶光密度值/β-actin條帶光密度值。

1.2.6統計學處理試驗結果用SPSS 11.5統計分析軟件處理，數據用x±s表示，進行t 檢驗及方差分析。

2結果與分析

2.1總RNA抽提結果

所提取RNA經紫外分光光度計檢測A260 nm /A280 nm比值為1.75。

2.2RT-PCR結果

由表2可見，bcl-2和Bax mRNA的表達均降低（P < 0.01），bcl-2下降的百分率為86.45%。bcl-2/Bax mRNA的比值用藥組較對照組降低84.19%，有顯著性差異（P < 0.01）。

bcl-2基因（即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一種原癌基因，編碼的bcl-2蛋白是一種膜整合蛋白，定位于線粒體膜、核膜和內質網膜上[4]。有報道說bcl-2能穩定線粒體跨膜電位，抑制線粒體通透性轉變孔的開放及細胞色素C的釋放，使細胞對凋亡的敏感性降低[5]，從而抑制細胞凋亡和延長細胞壽命，可以引發腫瘤。本試驗顯示，0.1mg·mL-1槲寄生堿作用SMMC-7721細胞24 h后bcl-2 mRNA的表達明顯降低，說明槲寄生堿抑制SMMC-7721細胞增殖與降低bcl-2 mRNA表達水平有關。

參考文獻：

[1] 李佩文.實用臨床抗腫瘤中藥[M]. 沈陽：遼寧科學技術出版社， 2001:132-133.

[2] 孔凡青.槲寄生堿對人肝癌細胞SMMC-7721生長抑制作用的研究[J].包頭醫學院學報，2007（4）：354-355，359.

[3] 張傳海.亞砷酸體外抗人肝癌細胞作用及其相關機制的實驗研究[D].合肥：安徽醫科大學，2005.

[4] Jacobson M D， Burne J F， King M P， et al. Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA[J]. Nature，1993，361(6410):365-369.

[5] Shimizu S， Narita M， Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apopogeniccytochrome C by the mitochondrial channel VDAC[J]. Nature， 1999， 399 (6735)：483-487.