利用EST-SSR標(biāo)記鑒定大白菜雜交種純度的研究

摘要：利用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)，選用自主開發(fā)的3對EST-SSR引物，對13個大白菜品種的總DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明：EST-SSR標(biāo)記可以體現(xiàn)品種內(nèi)的一致性、親本間以及品種間的多態(tài)性，具有共顯性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性的特點(diǎn)；EST-SSR標(biāo)記可以快速、準(zhǔn)確地鑒別大白菜品種的真實(shí)性和雜交種純度，為大白菜種子質(zhì)量的高效檢測提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大白菜；種子純度；鑒定；EST-SSR 標(biāo)記

中圖分類號：S634.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2010.06.001

Use of EST-SSR Markers to Identify the Seed Purity of Chinese Cabbage Cultivars

ZHANG Shu1，2， ZHOU Xin-cheng1， LI Li-bin1， LIU Li-feng1， LI Hua-yin1， SONG Mei-fang1， GAO Jian-wei1，2， GAO Ling2

（1.Institute of Vegetables， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Shandong Key Laboratory of Greenhouse Vegetable Biology， Shandong Branch of Natonal Vegetable Center， Jinan， Shandong 250100， China；2.College of life Science， Qingdao Agricultural University， Qingdao，Shandong 266109， China）

Abstract：The seed purity of 13 Chinese cabbage cultivars by the PCR-base assays with the templates of total DNAs and three EST-SSR primers developed from GenBank Database were identified. The results showed that there were significant polymorphisms among different cultivars or betwwen parents. The co-dominant bands were also found among the hybrids and their parents in our experiments. Concludely， the EST-SSR markers could be used to assess genetic purity of Chinese cabbage hybrid seeds and identify different cultivars.

Key words: Chinese cabbage (Brassica rapa L .ssp. pekinensis); seed purity; identification; EST-SSR markers

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis，AA染色體組，2n=20）為十字花科蕓薹屬植物，原產(chǎn)于中國，是中國和東亞國家的主要蔬菜之一。品種的差異直接影響著大白菜的生產(chǎn)和使用性能，因此大白菜品種鑒別和純度鑒定工作非常重要。傳統(tǒng)的最可靠的種子純度檢測方法是GOT[1]（grow-out test）法，它是通過田間種植，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對雜交種進(jìn)行鑒定。GOT法的最大缺點(diǎn)是費(fèi)時費(fèi)力、容易受環(huán)境和主觀因素的影響。近年來，同工酶、蛋白質(zhì)電泳法可以用于蔬菜種子純度的鑒定，然而，一些親緣關(guān)系近、來自同一地區(qū)的蔬菜品種由于蛋白質(zhì)電泳的多態(tài)性少，往往難以區(qū)分。因此，建立一套快速、精確、廉價的蔬菜種子純度檢測技術(shù)，顯得非常必要。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記越來越多的被應(yīng)用于種子純度鑒定中，如以分子雜交為基礎(chǔ)的RFLP (Restriction fragment length polymorphism)、以酶切和PCR為基礎(chǔ)的AFLP(Amplified fragment length polymorphism)、以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的RAPD (Random amplified polymorphic DNA)、SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)、STS (序列標(biāo)記位點(diǎn))、SSR (Simple sequence repeat)、DAF(DNA amplified fingerprint)、ISSR (Inter simple sequence repeat)等 [2]。與其它分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。SSR標(biāo)記在單個座位上能檢測到的多態(tài)性遠(yuǎn)高于其它幾種分子標(biāo)記，而且它廣泛、隨機(jī)、均勻地分布于整個基因組，具有共顯性遺傳的特點(diǎn)；SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確高效地鑒別大量等位基因；利用雜交種雙親在一些SSR位點(diǎn)的差異，可以將呈父母本互補(bǔ)帶型的雜交種與其雙親、甚至也可以將一些異源花粉造成的雜交種區(qū)分開。由于上述特點(diǎn)，SSR標(biāo)記逐步成為蔬菜作物品種鑒定的理想分子標(biāo)記之一。

迄今為止，SSR標(biāo)記已在多種農(nóng)作物種子的品種純度鑒定中得到應(yīng)用。李新海等[3]利用SSR標(biāo)記研究了70份中國主要玉米自交系的遺傳變異；番興明等[4]利用SSR標(biāo)記將中國溫帶玉米主要雜種優(yōu)勢群進(jìn)行了劃分；李穩(wěn)香等[5]用SSR標(biāo)記對10個雜交水稻組合的子一代種子純度進(jìn)行了鑒定；彭鎖堂等[6]對中國9個主要的雜交水稻組合及其親本進(jìn)行了SSR標(biāo)記分析；此外徐如宏[7]、關(guān)榮霞[8]、劉勤紅[9]、艾呈祥[10]利用SSR標(biāo)記分別對小麥、大豆、棉花、西瓜、甜瓜等作物及蔬菜作物種子進(jìn)行了純度鑒定。陳琛等[11]開發(fā)了甘藍(lán)的EST-SSR標(biāo)記，李麗和鄭曉鷹[12]建立了用于白菜和大白菜品種鑒定的由3個引物對組成的6套EST-SSR復(fù)合標(biāo)記組合。但是有關(guān)大白菜EST-SSR引物的開發(fā)遠(yuǎn)未達(dá)到飽和。為了提高EST-SSR標(biāo)記的密度和大白菜品種鑒定的效果，有必要開發(fā)更多的EST-SSR標(biāo)記。本研究利用自主開發(fā)的3對新EST-SSR引物對13個大白菜品種（系）進(jìn)行純度鑒定，為將EST-SSR標(biāo)記鑒定技術(shù)應(yīng)用于大規(guī)模大白菜種子純度檢測提供有益的參考。

1材料和方法

1.1植物材料與模板DNA的提取

本研究選用了13個大白菜品種（系）：691（自交系）、690（自交系）、雜交種773 (691×690)、668（自交系）、663（自交系）、雜交種761（668×663）、7個商業(yè)用品種（夏白1號、夏白45、夏優(yōu)2號、夏優(yōu)5號、高抗2號、豐抗78、早熟5號）。上述材料均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

以改良的CTAB法提取總DNA[13]。

1.2 EST的獲得與處理

開發(fā)引物所用的大白菜EST序列來自GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），時間截止到2007年10月31日，共有白菜（Brassica rapa）EST序列180 611個，其中大白菜（B. rapa ssp. pekinensis）EST序列147 217個。本研究采用147 217個大白菜EST序列開發(fā)SSR引物。

對下載到的大白菜EST序列參照葛佳等[14]的方法進(jìn)行前期處理，包括除去EST序列中存在的載體序列5'端及3`端polyT（5'端）和polyA（3`端）序列以及含有歧義堿基（ambiguous bases）的序列，除去小于100 bp的序列。然后利用SeqMan程序（Lasergene軟件包，DNAStar Inc.）對處理后的EST序列進(jìn)行重疊群（contigs）構(gòu)建。用MISA軟件（http://www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa）在構(gòu)建的重疊群中篩選SSR標(biāo)記，標(biāo)準(zhǔn)參見Zhang等[15]。選取其中的3對引物用于本試驗(yàn)（表1）。

1.3PCR擴(kuò)增

設(shè)計的3對SSR引物在上海生工合成，溶解后稀釋成2 μmol·L-1備用。PCR采用20 μL反應(yīng)體系：40 ng模板DNA， 1× PCR buffer（含20 mmol·L-1 MgCl2），200 μmol·L-1NTPs，引物0.1 μmol·L-1，1U TaqDNA聚合酶；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸1 min，共計35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃10 min終止反應(yīng)。

1.4聚丙烯胺凝膠電泳分離與多態(tài)性檢測

PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰氨凝膠電泳后銀染檢測。PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻后，取4 μL點(diǎn)樣，在Sequi-Gen RGT核酸電泳系統(tǒng)(Bio-Rad， USA)中進(jìn)行電泳分離，電極緩沖液為1×TBE。在25 ℃、2 000 V恒壓下電泳2 h，通過銀染法顯影[16]，拍照、記錄結(jié)果。

2結(jié)果與分析

本試驗(yàn)利用3對EST-SSR引物（BRE28、BRE121和BRE131）對13個大白菜品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并利用6%聚丙烯酰氨凝膠電泳后銀染檢測。發(fā)現(xiàn)這3對EST-SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物都呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型，而且?guī)烷g大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分雜交種和親本自交系（圖1）。圖1中1~9泳道是我們配制的3組親本自交系，10~18泳道是市售雜交種。試驗(yàn)用的模板DNA來自保護(hù)地栽培的大白菜球葉。可以看出，通過特征條帶完全可以區(qū)分不同的親本自交系和雜交種。

分別取100粒自交系690種子、100粒夏優(yōu)2號品種種子發(fā)芽，提取總DNA。利用3對EST-SSR引物（BRE28、BRE121和BRE131）分別對上述200份材料的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增。電泳圖顯示（電泳圖略），100粒自交系690種子對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物之間，帶型一致；100粒夏優(yōu)2號品種種子對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物之間，帶型也一致。這些結(jié)果說明，這3對EST-SSR引物用于品種純度檢測，可以體現(xiàn)品種內(nèi)的一致性。

3討論

SSR通?？梢苑譃榛蚪MSSR (genomic SSR)和EST-SSR(genic SSR)兩大類?；蚪MSSR是基于基因組序列開發(fā)的，開發(fā)起來費(fèi)時費(fèi)力，而且因?yàn)樘结樀木壒?，種類比較局限 [17]。EST-SSR是存在于表達(dá)的基因序列內(nèi)的SSR，不包括存在于內(nèi)含子及非表達(dá)的調(diào)控區(qū)內(nèi)；EST-SSR通常3個堿基重復(fù)的占多數(shù)，與不引起基因翻譯過程中移碼現(xiàn)象的發(fā)生相一致 [18]，所以EST-SSR 有更強(qiáng)的種屬轉(zhuǎn)移性 [19]。目前，在GenBank中， Brassica rapa的EST序列已達(dá)180 611條，大白菜（Brassica rapa L .ssp pekinensis）的EST序列也已超過140 000條。我們可以利用這些EST序列開發(fā)SSR引物。隨著多國蕓薹屬基因組工程（Multinational Brassica Genome Project）尤其是韓國大白菜基因組工程（Korea Brassica Genome Project）的啟動與研究工作的快速進(jìn)展，在GenBank中可獲得大量的大白菜基因組序列數(shù)據(jù)，這為利用數(shù)據(jù)庫搜索法開發(fā)大白菜基因組上的SSR引物奠定了基礎(chǔ)。SSR擴(kuò)增產(chǎn)物通常采用高濃度的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，可以顯示出不同品種間重復(fù)次數(shù)的差異[14，20]，具有多態(tài)性高、可靠性高、技術(shù)難度低、共顯性等優(yōu)點(diǎn)。因此，EST-SSR非常適合大白菜品種純度的檢測。

SSR標(biāo)記有很廣泛的用途，例如多樣性評價，基因定位，輔助選擇育種等。EST-SSR是SSR標(biāo)記的1個種類，它也可以在這些方面加以應(yīng)用。與非功能基因區(qū)的SSR相比，EST-SSR具有較高的物種間的轉(zhuǎn)移率[21]，但是其多態(tài)性較低。因此，應(yīng)用EST-SSR標(biāo)記鑒定雜種后代純度時需要篩選更多的引物，才能找到父母本間有差異的多態(tài)性標(biāo)記。目前，大白菜制種工作是以利用自交不親和系為主，引起雜種不純的主要原因是在F1雜交種中混有一些母本的自交種，這種自交種一般是純合的，只需用1個父母本有差異的SSR標(biāo)記就可鑒定出來。在實(shí)際制種工作中，也存在由于隔離不徹底造成外來花粉產(chǎn)生種子純度不純的現(xiàn)象。針對第2種現(xiàn)象，利用EST-SSR引物時就不能僅靠1~2個多態(tài)性標(biāo)記，而要篩選更多的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行鑒定，這是我們在利用EST-SSR標(biāo)記鑒定種子純度等工作中應(yīng)注意的問題。

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