同種異體耳移植的實驗研究

[摘要]目的:①觀察同種異體兔耳移植后排斥反應的組織病理學、細胞免疫、體液免疫變化的情況;②為提高同種異體移植耳成活率，預防排斥反應，提供一個有效的免疫抑制治療方案。方法:以青紫藍兔和日本大耳白兔為實驗動物。以耳大動、靜脈及外側耳緣靜脈為蒂，獲得單側(右)全耳，應用顯微外科微血管吻合技術進行異體移植。其中青紫藍兔為受體，日本大耳白兔為供體。實驗共選用40對(青紫藍兔和日本大耳白兔各40只)動物，按受體免疫抑制劑治療方案隨機分為5組:O組，手術對照組(N=5對)，行自體兔耳離斷回植術;C組，對照組(N=5對)，同種異體耳移植后不給予免疫抑制劑;T1組(N=10對)，同種異體耳移植后給予FK506單一免疫抑制劑;T2組(N=10對)，同種異體耳移植后給予FK506 和強的松兩聯免疫抑制劑;T3組(N=10對)，同種異體耳移植后給予FK506、MMF和強的松三聯免疫抑制劑。動脈、靜脈吻合均選用端端吻合技術。術后觀察移植耳存活情況、急性排異發生率及嚴重程度;供體組織病理分級;受體血漿IL-2、IL-4、 IL-8的變化以及受體T淋巴細胞CD4+、CD8+的變化。結果:同種異體兔耳移植30天、100天后T3組在急性排斥反應發生率、供體組織病理分級和受體IL-2、IL-4、 IL-8水平與CD4、CD8值的變化等方面與C組、T1組、T2組相比較均有顯著差異(P<0.05)。結論:三聯免疫抑制劑方案(FK506、MMF和強的松)是預防同種異體兔耳移植排斥反應的一個有效治療方案。

[關鍵詞]同種異體移植;耳再造;免疫抑制;排斥反應

[中圖分類號]R622Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)03-0353-05

Research of ear allotransplantation in rabbbits

LIU Ping，LIU Yi，ZHANGXu-sheng，ZHANG Bin，XIAO Bin，LI Qiu-jin

(Department of Burns and Plastic Surgery， Lanzhou General Hospital， Lanzhou Command of PLA，Lanzhou 730050，GanSu，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the pathologic changes of rejection after ear allo-transplantation in rabbit，and find an effective therapic strategy of immune suppression to improvethe survival rate of allotransplanted ear andprerent rejection. MethodsLivid blue rabbits and Japan big ear white rabbits were used as experiment animals. A free right ear based on common auricularis magna artery with auricularis magna vein and auricularis edge vein was harvested from donor (livid blue rabbit)， then allotransplanted to recipient (Japan big ear white rabbits) with microvarscular anastomosis technique. 40 couples of rabbits were divided into five groupsrandomly according to different scheme of immunosuppressive treatment. Group O (n=10) and group C (n=5) were auto-transplantion and allo-transplantation respectively， and were not given any immunosuppressive agent. Group T1， T2 and T3 (each with ten couples of rabbits， n=10) were givenFK506， FK506 combined with prednisone and FK506 combined with prednisone plus respectively. Then， the survival rates of transplanted ears， the incidence rate of rejection and its histopathologic grade， the levels of IL-2， IL-4 and IL-8 in plasma and CD4+， CD8+ in lymph cells of donor rabbits were examined.Results At day 30， 60 and 100 after allotransplantation， the incidence rate of rejection， thehistopathologic grade of skin biopsy specimen and the expression levels of IL-2， IL-4 and IL-8 were significantly lower in Group T3 than the other groups，all examined indexes above showed obvious difference from those in group C， group T1 andgroup T2 (P<0.05).ConclusionThe combined of FK506， MMF and prednisone scheme is a effective therapeutic strategy to prevent rejection after ear allo-transplantation.

Key words: allograft; auricle reconstruction; immunosuppression;immunologicreaction

嚴重燒傷、創傷、腫瘤術后以及先天性因素所致耳缺損、耳畸形的患者，除了在生理上承受因耳缺損、畸形所造成的功能障礙外，在心理上也承受著極大的痛苦。全耳再造術是整形外科體表器官再造中最困難、最具挑戰性的工作，目前的修復手段僅能做到使耳郭的形狀和正常耳大致相似，還不能使其各細微結構和軟骨的彈性完全與正常耳匹配[1]，而且肋軟骨的切取破壞了胸廓的完整性，再造耳軟骨支架的吸收變形則嚴重影響再造耳外形的遠期效果。

隨著新型、高效免疫抑制劑的問世，器官移植得到了飛速的發展，同種異體復合組織移植也取得了令人矚目的進展，但是同種異體復合組織移植尚存在操作技術、排斥反應、倫理道德等諸多問題。本研究利用兔耳移植模型，旨在探討同種異體兔耳移植后排斥反應的病理學變化與細胞免疫、體液免疫的變化，研究制定有助于提高移植耳成活率，預防排斥反應的免疫抑制方案，為臨床上成功實施同種異體耳移植提供有益的實驗基礎。

1材料和方法

1.1 實驗動物:選用體重均等的40只青紫藍兔和40只日本大耳白兔為實驗動物。體重(1.9±0.1)kg，3月齡，雌雄不限，均購于蘭州生物制品研究所動物實驗科，由專人負責單籠封閉式飼養。以青紫藍兔為受體，日本大耳白兔為供體(圖1)。

1.2 主要實驗試劑:CD4、CD8鼠抗兔試劑盒，購于英國SEROTEC公司， IL-2、IL-4、IL-8鼠抗兔試劑盒，購于美國ADL公司，他克莫司(FK506)膠囊購于英國Aslcllns Ireland 公司，嗎替麥考酚酯膠囊(MMF)購于上海羅氏制藥有限公司，醋酸潑尼松購于浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.3 同種異體兔耳移植模型的建立:2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)耳緣靜脈麻醉后，沿供體右耳根處環形剪開皮膚，分離皮下組織，將內側耳緣靜脈與外側耳緣靜脈分支結扎，分離出外側耳緣靜脈、耳大靜脈、耳大動脈，將受體同法分離出右耳外側耳緣靜脈，耳大靜脈，耳大動脈，血管夾依次阻斷血流，剪斷血管后用組織剪沿耳根離斷受體右耳，結扎出血點，鹽水紗布濕敷創面;供體耳大動脈，耳大靜脈，外側耳緣靜脈血管夾阻斷血流后，依次剪斷血管，用組織剪沿耳根剪斷右耳;將供體耳軟骨與受體耳根軟骨對位，先于外側耳緣靜脈旁軟骨處縫合固定，再將內側耳緣靜脈旁軟骨縫合固定，再在耳大動脈旁固定耳軟骨后，間斷對位縫合固定耳軟骨。將供體顴耳肌與受體耳根顴耳肌對位拉攏縫合，保證術后移植耳豎立。顯微鏡下將對位的血管旁皮下組織間斷縫合固定后，分別吻合外側耳緣靜脈，耳大靜脈，耳大動脈，均行端端吻合。吻合畢，依次放開耳大動脈、耳大靜脈、外側耳緣靜脈血管夾，即見動脈搏動良好，兩根靜脈充盈明顯，行勒血試驗，見動靜脈血流通暢，移植耳血運良好，全層縫合皮膚關閉切口(圖2)。

1.4 實驗分組與免疫抑制劑的應用

1.4.1 實驗分組:將40只青紫藍兔與40只日本大耳白兔按體重大小與耳大小配對，然后按受體應用免疫抑制劑的不同分為5組。O組:手術對照組(N=5對)，行自體兔耳離斷回植術;C組:對照組(N=5對)，異體移植后不給予免疫抑制劑;T1組:(N=10對)異體移植后給予FK506;T2組(N=10對):異體移植后給予FK506 +強的松兩聯免疫抑制劑;T3組(N=10對):異體移植后給予FK506+MMF+強的松三聯免疫抑制劑。

1.4.2 免疫抑制劑的應用:術前1天晚8點及術前30min各組試驗動物依據分組不同應用不同的免疫抑制劑，各給藥一次。藥物及用量分別為:T1組，FK506 0.2 mg/kg;T2組，FK506 0.2 mg/kg，強的松2mg/kg; T3組，FK506 0.2 mg/kg，MMF20mg/kg，強的松2mg/kg。移植術后藥物用量分別為:①強的松1mg/kg， 晚8時，1次/天。1月后降為0.5mg/kg，晚8時，1次/天;②FK506 0.2mg/kg，分兩次給予，早8時晚8時;③MMF20mg/kg，分兩次給予，早8時晚8時。

急性排斥反應發生時用藥:①加大強的松用量，行“激素沖擊治療”，2mg/kg，2次/天，連用5天至急性排斥反應緩解后，恢復至正常藥量;②加大FK506用量，0.2 mg/kg，2/天，待急性排斥反應控制平穩后恢復至正常藥量(一般為10～14天);③青霉素抗炎治療:青霉素20 000U/ kg，2/天，連續3天。

1.5 觀察指標

1.5.1大體觀察:術后觀察并詳細記錄移植兔耳的變化(皮溫、皮色、腫脹及毛細血管充盈情況等)、存活情況及兔全身反應情況。

1.5.2 病理檢查與病理學分級觀察:分別在術后30天與100天采集各組移植耳標本進行組織病理學檢查:以移植兔耳內側面畫“十”字定為兔耳正中處，“十”字正中交叉點旁偏內側1 cm處手術刀切取全層組織， 10%福爾馬林固定，常規脫水、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察各組標本組織結構及細胞浸潤的情況。確定排異反應的輕重并分級。排斥反應依據Muramatsu[2]的分類按輕重程度分為四級:0級，無排斥反應;1級，輕度排斥反應;2級，中度排斥反應;3級，重度排斥反應。對各組30、100天的病理學標本進行分級總結，而后進行統計學分析，確定各組的免疫抑制效果。

1.5.3 細胞免疫狀態觀察(CD4+、CD8+測定):分別在術前、術后7、14、30、100天采取靜脈血，用流式細胞儀計數檢測各組受體血清中T淋巴細胞亞群CD4+與CD8+的含量，及CD4+/CD8+值。

1.5.4 體液免疫狀態觀察(IL-2，IL-4，IL-8測定):分別在術前、術后7、14、30、100天采取靜脈血，用ELISA法檢測各組受體血清中IL-2 ，IL-4，IL-8水平的變化。

1.5.5 術后并發癥觀察:術后觀察手術傷口有無感染，有無皮癬、肺炎、腸炎等并發癥發生情況。

1.6 統計學分析:所有數據以x±s表示，并采用SPSS 11.0統計軟件處理。病理分級結果采用秩和檢驗，進行統計學分析;CD4+、CD8+、CD4+/CD8+與IL-2、IL-4、IL-8用重復測量方差分析進行統計學分析，P<0.05，差別有統計學意義。

2結果

2.1大體觀察:排斥反應大體表現為:移植耳皮膚組織質地由耳根到全耳逐漸腫脹、變硬，膚色變紅，局部皮溫升高，隨著腫脹逐漸加重，膚色逐漸加深，移植耳內外皮膚表面部分區域出現水皰、組織液滲出、表皮潰爛，及脫毛等癥狀，隨后局部皮膚出現暗紅、青紫色斑塊，組織繼續加劇腫脹、硬化，皮溫上升，移植耳漸呈紫黑色，至整個移植耳變黑，溫度明顯下降，100%壞死。

O組:除1例發生靜脈血栓外，其余均未發生任何并發癥，9只原位回植耳均成活良好。

C組:術后均發生排斥反應，移植耳壞死。實驗動物移植耳術后成活時間:9～11天，平均成活10.2天(1例超急性排斥反應，術后10min發生血管栓塞，致移植耳壞死)。

T1組:均發生排斥反應，移植耳壞死。實驗動物移植耳術后成活時間:6～10天，平均成活7.6天(1例術后第2天發生血管栓塞)。

T2組、T3組動物在移植術后100天移植耳存活例數為4例與6例(圖3、4)。急性排斥反應共發生7例T2組4例，T3組3例。發生時間分別為:第13、20、40、75天與16、28、67天。經抗急性排斥反應治療后，成功逆轉急性排斥反應3例(T2組1例，T3組2例)。

2.2 各組移植耳排斥反應情況的病理檢查:從表2、3中T2組與T3組在30天、100天各組病理學分級可以看出兩組病理學分級有差異，T3組的病理學分級明顯低于T2組(圖5～8)。說明三聯用藥對同種異體耳移植術后排斥反應的抑制作用明顯優于兩聯用藥。

2.3CD4+、CD8+、CD4+/CD8+檢測

2.3.1 不同時間點間CD4+的檢測結果:表4中T2組的CD4+術后均高于T3組，表示了不同時間段T3組對免疫排斥反應良好的控制。移植術后7～30天是急性排斥易發生的時間段，CD4+呈明顯的升高表現，本實驗中發現急性排斥反應臨床表現還未出現時，CD4+檢測值已發生明顯的增高。結果提示CD4+為移植后監測急性排斥反應的一項敏感指標。術后不同時間點間CD4+的流式細胞儀檢測結果:見圖9～12，T2組實驗動物與實驗動物在術后30天、100天CD4+檢測值有明顯差異，T3組CD4+均低于T2組，表明三聯用藥組，對異體排斥反應控制較兩聯理想。

2.3.2 不同時間點間CD8+的檢測結果:各組不同時間CD8+的檢測值差異無統計學意義(表5)，本實驗結果提示CD8水平的檢測不能反映移植排斥反應情況。

2.3.3 不同時間點組間CD4+/CD8+值的檢測結果:表6中各組不同時間CD4+/CD8+比值對比明顯，術后T3組均低于T2組，表明T3組免疫抑制效果較T2組理想。

2.4 IL-2、IL-4、IL-8水平檢測

2.4.1 不同時間點IL-2的檢測結果:表7檢測值中可得到T2組與T3組比較，在不同時間點，T3組Il-2的水平均比較低，說明三聯用藥組，對異體排斥反應控制良好。

2.4.2不同時間點IL-4的檢測結果:表8中T3組在術后30、100天時IL-4水平低于T2組，說明三聯用藥，對異體排斥反應控制較兩聯理想。

2.4.3 不同時間點IL-8的檢測結果:各組不同時間血清IL-8水平的檢測結果差異無統計學意義(表9)，可認為T2、T3兩組間IL-8無差異、不同時間點IL-8的變化無差異。

2.5 術后并發癥:本實驗中所有實驗動物手術切口均I期愈合，未觀察到任何并發癥發生。

3討論

隨著現代醫學相關學科的快速發展，全耳再造技術日臻成熟，并取得了良好的近期效果，但因再造耳支架缺乏軟骨膜，作為支架材料再造耳后其營養問題難以得到充分保障，所以存在軟骨吸收變形等問題，由此影響再造外耳的遠期效果。于是尋找一種更好的耳再造方法成為學者們研究的重點。同種異體耳移植為小耳畸形、耳缺損的修復再造提供了一種全新的手段。但是同種異體耳移植與其它器官移植不同，心、肝、肺、腎等器官移植者往往伴有嚴重的危及生命的疾病，應用器官移植可以挽救患者的生命;但對于耳缺損、畸形患者來說，手術治療完全是為了達到美容目的，但無論是前者還是后者，移植術后均需長期應用免疫抑制劑以預防排斥反應，而長期應用免疫抑制劑，除要承受巨大經濟負擔外，在目前條件下可能會帶來毒副作用，因此，就同種異體耳移植來講，存在許多倫理學問題。本實驗目的是:通過同種異體耳移植的實驗研究，探討適用于同種異體耳移植的可行性以及篩選適宜的免疫抑制治療方案，為未來的實驗與臨床研究提供初步實驗依據。

免疫抑制劑的應用是控制同種異體器官移植排斥反應，保證手術成功的重點。尋找低毒無害的免疫抑制方案也一直是目前研究的熱點。為了有效的抑制急性排異反應，在異體移植后應用CsA(環孢素A)或FK506、Aza(硫唑嘌呤)或MMF、強的松等組成的三聯免疫移植劑是一個傳統方案，相比較CsA，AZA和強的松等組成的三聯抑制方案，FK506、MMF和強的松等組成的三聯抑制方案，在器官移植中顯示了更加良好的效果。復合組織同種異體移植包括了多種組織成分，皮膚又是抗原性最強的免疫器官，是機體主要的免疫攻擊對象。皮膚的免疫排斥比肌肉、骨骼、軟骨、肌腱發生早且嚴重，在進行世界首例的手移植之前，Jones等[3]用豬同種異體肢體移植模型為實驗動物，通過各種實驗方案的對比，確定了FK506、MMF、和強的松的三聯免疫抑制方案的可行性，隨后世界各地進行的30余例手移植中基本上都采用以FK506、MMF、和強的松為基礎免疫抑制方案，并獲得了成功[4]。世界首例與我國首例同種異體顏面移植均應用了FK560、驍悉、強的松為免疫抑制劑的抗排斥方案[5-6]。吳衛真等[7] 對比免疫抑制劑在兒童腎移植中的應用效果后，強烈推薦應用MMF、FK506和強的松三聯用藥，因為和其它免疫移植方案比較，該方案療效好，而毒副作用方面沒有增加。為了研究同種異體耳移植的免疫抑制方案和手術策略，本實驗對比研究了FK506+MMF+強的松， FK506+強的松和單一FK506的免疫抑制效果，結果顯示，FK506組術后均發生排斥反應，移植耳在6～10天內死亡;而二聯與三聯用藥組均存活了100天以上;術后30天和100天病理分級對比發現三聯用藥組免疫排斥反應低于二聯用藥組;代表機體免疫排斥程度的血清IL-2、IL-4水平、CD4+含量與CD4+/CD8+也顯示了相同的結果，由此證明三聯免疫抑制方案在同種異體耳移植中可以獲得良好的免疫抑制效果。研究證實，免疫抑制劑的使用必須是聯合用藥，在各種藥物協同發揮作用，減少藥物劑量的同時，降低了各種藥物的劑量，亦有效的降低了個別藥物的毒性，可以達到增效減毒的效果。通過本實驗對比研究發現，與二聯用藥組比較，三聯用藥組并沒有在術后并發癥等方面存在差別。也就是說，從藥物的毒副方面考慮，三聯用藥并不強于兩聯、單一用藥。

器官移植后發生排斥反應是導致受者死亡的最重要原因之一。器官移植后排斥反應發生時有許多細胞因子(Cytokine)參與這一復雜過程，其中白細胞介素(Interleuking)與移植排斥反應密切相關，如IL-2，IL-4，IL-8，IL-10，IL-15等。據文獻報道，器官移植后IL-2，IL-4表現為升高[8]。本實驗結果也顯示同種異體耳移植術后IL-2，IL-4水平較術前明顯增高，而IL-8在監測過程中無明顯變化規律。

有學者認為CD4和CD8在移植排斥反應中起重要作用[9]，臨床上人們常把CD4+T細胞與CD8+T細胞改變看作免疫功能異常的指標。CD4+/CD8+的比值代表了整體的免疫平穩，所測指標可較好的檢測排斥反應的發生。本實驗結果提示:CD4+為移植后監測急性排斥反應的一項敏感指標，CD8+則不能體現移植排斥反應的情況;二聯用藥組與三聯用藥組各組不同時間CD4+/CD8+比值對比明顯，三聯用藥組均低于二聯用藥組，表明CD4+/CD8+比值可以檢測免疫抑制的效果。

Tobin GR[10]在同種異體復合組織移植的進展與現狀中總結認為:“免疫配型、良好的免疫抑制方案、術前精心的患者及其家人生理與心理準備及術后強有力的免疫抑制劑支持與排斥反應監測，是保證同種異體復合組織移植成功的關鍵。在所有同種異體復合組織移植失敗原因報告中均由以上因素的過失所引起。這些寶貴的早期經驗使同種異體復合組織移植成為臨床常規的治療手段變得十分可能”。對于同種異體耳移植來講，除了前述因素外也存在著諸如異體耳來源問題、醫學倫理問題以及同種異體耳移植后必須承擔長期服用免疫抑制劑的風險和經濟負擔問題，所有這些問題都是在同種異體耳移植應用于臨床前臨床醫師必須認真思考并妥善解決的問題。

綜上所述，同種異體耳移植單純從技術層面上講是可行的，FK506、MMF和強的松結合的三聯免疫抑制治療方案，可明顯減輕同種異體兔耳移植后的排斥反應，是預防和治療同種異體兔耳移植排斥反應的一個有效的治療方案。

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[收稿日期]2009-11-12 [修回日期]2010-01-29

編輯/張惠娟