血管鈉肽通過抑制白細胞L-選擇素表達保護碾壓撕脫皮瓣

[摘要]目的:本研究組以往的工作已證實血管鈉肽(Vasonatrin peptide，VNP)對碾壓撕脫傷皮瓣有明顯的保護作用，本研究擬探討該作用是否通過抑制皮瓣損傷后白細胞的L-選擇素表達介導。方法:24只大鼠隨機分為3組(n=8)，分別為SHAM手術組、碾壓撕脫組及VNP+碾壓撕脫組，于術前及術后12h取材，HE染色觀察組織學改變和白細胞浸潤情況，并通過免疫組織化學染色對表達于白細胞表面的L-選擇素進行標記以明確VNP對碾壓撕脫皮瓣的具體作用。結果:碾壓撕脫組皮瓣組織損傷情況較重，可見大量中性粒細胞浸潤，其表面的L-選擇素表達也隨之升高，而VNP治療組皮瓣中的中性粒細胞數目明顯減少，其所表達的L-選擇素也較前者顯著降低(P<0.05)。結論:VNP可抑制白細胞表面L-選擇素的表達，顯著抑制碾壓撕脫傷后皮瓣局部白細胞的活化，減輕其粘附和浸潤，進而減輕炎癥反應，抑制血栓形成，從而為臨床上提高碾壓撕脫皮瓣成活率并改善預后提供一種新的治療思路。

[關鍵詞]血管鈉肽;白細胞;皮瓣碾壓撕脫傷; L-選擇素

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)03-0337-04

Vasonatrin Peptide(VNP)protected the crush-avulsion injured skin flap from necrosis via inhibition of the expression of L-selectin on leucocytes

WANG Shi-ping，LAN Zhi-yong，XIA Wei，GUO Shu-zhong，ZHAO Qian，LIU Bei，PAN Bao-hua

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectivePrevious studies of our group showed that the Vasonatrin peptide(VNP)had protective effect on the cursh-avulsion injured skin flap. This study was designed to investigate whether the protection effect of VNP conducted via inhibition of expression ofL-selectin on leucocytes.MethodsTwenty four rats were randomly divided into three groups: the SHAM operation group， the crush injury group and the VNP treated group. Tissue samples from skin flap were collected before surgery and 12h after surgery， Hematoxylin-eosin stain was used to observe the histological change and inflammatory cell infiltration. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of L-Selectin on leucocytes in the skin flap of each group， by which we can affirm the effects of VNP. ResultsCompared with the VNP treated group， tissue damage was more serious and a mass of inflammatory cell infiltration was observed， and the expression of L-Selectin was significantly higher(P﹤0.05) in the crush injury group. Conclusion VNP，which could mitigate inflammatory reaction and inhibit thrombosis by decreasing the inflammatory cell infiltration and down regulating the expression of L-Selectin in the crush injury， has the potential to be a new therapeutic drug for clinical application.

Key words: Vasonatrin peptide (VNP); Leucocytes; Flap crush injury; L-Selectin

我們以往研究證實，在碾壓撕脫傷發生后，會發生非常復雜的病理生理學改變，其中白細胞對組織損傷會發揮重要的作用，參與了炎癥反應和血栓的形成，白細胞在炎癥反應區域集中，對炎癥的加重及血栓的形成和發展起到關鍵的作用，進而造成碾壓撕脫組織內形成廣泛的微血栓，導致組織缺血引起撕脫繼發性壞死的發生[1]。碾壓撕脫傷發生后，白細胞首先通過在血管壁上緩慢滾動開始發揮其在炎癥反應中的作用，而白細胞與血管壁接觸這一使動步驟是由其表面的L-選擇素通過與相應配體結合來介導的[2]。本實驗觀察應用血管鈉肽(Vasonatrin peptide，VNP)后碾壓撕脫皮瓣組織中白細胞浸潤和L-選擇素表達情況的改變，研究其對碾壓撕脫皮瓣組織的保護作用機制，為臨床救治提供指導。

1材料和方法

1.1 實驗動物模型及分組:清潔級SD大鼠24只(第四軍醫大學實驗動物中心提供)，雌雄不限，體重220-280g，普通喂養。將24只大鼠隨機分為三組，每組8只，A組為SHAM手術組(皮瓣掀起后直接原位縫合，不進行碾壓撕脫)，B組為單純碾壓撕脫組(生理鹽水1ml/kg腹腔注射， 1次/日)，C組為碾壓撕脫傷后VNP治療組(VNP 0.1mg/kg靜脈注射， 1次/日)。實驗方法詳見先前實驗[3]，簡述為:在大鼠背部形成3cm×9cm長方形任意皮瓣，使用皮膚碾壓撕脫傷模型機制作碾壓撕脫傷皮瓣模型(第四軍醫大學西京醫院整形外科研制，專利號:ZL 2008 2 0221813.3)。

1.2免疫組織化學:術前及術后12h，各組于皮瓣中遠1/3交界處切取全層皮瓣組織1cm×2cm，所取組織立即用10%福爾馬林固定，石蠟包埋備用。各組皮瓣組織標本分別進行常規HE染色及免疫組織化學染色。本實驗采用免疫組織化學超敏S-P試劑盒(購于福州邁新生物技術開發有限公司)對組織進行染色，具體染色步驟按照先前實驗進行[3];一抗L-Selectin(購于Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz， CA， USA)。結果判定:胞質中有棕黃色顆粒者為陽性。每張切片在高倍鏡(400倍)下隨機選取5個不重復視野，在同一背景條件下取圖并進行灰度處理后用Image-Pro Plus6.0軟件測定平均積分光密度(IOD)。

1.3統計學處理:實驗數據以x±s表示，用SPSS12.0(SPSS Inc. Chicago， Illinois)統計軟件處理，組間比較用采用方差分析，P﹤0.05，差異有顯著性。

2結果

2.1 皮瓣成活率:通過我們的前期工作已證明，使用我科自行研制的皮膚碾壓傷模型可以制作出穩定可重復的碾壓皮瓣。皮瓣碾壓后，組織自遠端1/3開始逐漸發生干性壞死，隨著時間推移，原本看似有活力的組織也開始發生壞死表現，表皮脫屑、變硬等繼發性壞死特征相繼出現，至術后7天壞死和成活組織呈現明顯界限。此時計算各組皮瓣的成活率(皮瓣成活率=皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積×100)，結果如下:A組(SHAM): 61.12±4.92;B組(單純碾壓撕脫):37.42±4.36;C組(碾壓撕脫+VNP):49.96±1.32。 可以看出VNP治療能顯著提高皮瓣的成活面積(P<0.05)，減少繼發性壞死的發生。

2.2 組織損傷和白細胞浸潤:為進一步了解碾壓傷后組織損傷情況和VNP的作用，我們選擇在傷后12h于皮瓣中遠1/3交界處取材，進行組織學檢測。HE染色見SHAM手術組皮瓣組織形態正常、結構完整，未見明顯炎細胞浸潤，微血管中血流通暢(圖1)。碾壓撕脫組皮瓣可見組織的形態和完整性遭到明顯破壞，大量炎細胞浸潤，血管內可見明顯中性粒細胞大量出現，部分管腔內充滿中性粒細胞，可見白細胞貼壁，有附壁血栓形成(圖2)。VNP治療組皮瓣組織損傷情況得到明顯改善:組織雖有水腫，但其形態結構尚完整，炎細胞浸潤較單純碾壓皮瓣有明顯減少，大多聚集在血管壁外周，管腔內充血，僅有少量中性粒細胞存在于管腔之中，可見白細胞附壁現象，尚未見明顯血栓形成(圖3)。

2.3 L-選擇素免疫組織化學染色:L-選擇素表達于多種白細胞，包括中性粒細胞、單核細胞等，是介導白細胞與內皮細胞初始作用和滾動的主要黏附分子[4]，因此我們挑選了L-選擇素這一指標來研究白細胞在碾壓撕脫傷中的作用。術前各組切片中L-選擇素表達未見明顯差異(P>0.05)。術后12h切片:SHAM手術組中L-選擇素陽性表達的細胞不多，多呈黃色、棕黃色等弱陽性表現(圖4);碾壓撕脫組皮瓣可觀察到大量L-選擇素陽性表達的細胞，且呈棕褐色的強陽性表現，并其多位于管腔內及血管周圍，尤其在管腔內呈大量聚集表現，這與中性粒細胞聚集部位相一致，證明了在碾壓撕脫傷早期白細胞因L-選擇素的高表達而聚集于管腔之中，并最終滲出浸潤至組織各處參與炎性反應過程(圖5);VNP治療組中L-選擇素的表達較碾壓撕脫組明顯減少，散在于管腔及內皮細胞周圍，說明VNP較好地抑制了白細胞在炎癥反應中的作用(圖6)。術后12h各組間平均積分光密度(IOD)差異具有顯著性(P<0.05)。見表1。

3討論

皮膚碾壓撕脫傷是整形外科的常見損傷，其損傷可分為原發性壞死和繼發性壞死，其中繼發性壞死往往導致傷后碾壓撕脫皮瓣大面積受損，是皮膚碾壓撕脫傷所特有的損傷特點，給患者的救治及預后恢復帶來很大難度。我科通過長期研究總結出繼發性壞死的主要病理改變為:血管內皮細胞損傷脫落，白細胞貼壁黏附、血管周圍大量炎性細胞浸潤，碾壓撕脫皮瓣中血流明顯下降，血管內大量微血栓形成。我們通過活體熒光觀察發現[5]，在碾壓傷發生后30min左右即可見少量白細胞隨血流沿血管壁游走滾動，后滾動速度逐漸減慢，最終停止而黏附于血管壁之上。而后隨著黏附的白細胞越聚越多，最終形成血栓阻塞管腔，可見白細胞的貼壁黏附形成附壁血栓是造成微循環障礙的主要原因。根據碾壓撕脫傷后以白細胞為代表的組織病理學改變及以往研究結果我們能得出:選擇素分子參與了繼發性壞死的損傷過程，并對傷后白細胞貼壁滾動、黏附、滲出及組織的病理變化有重要的作用[6-7]。

選擇素又稱凝集素樣細胞粘附分子(Lec-CAM)，介導細胞與細胞之間的粘附，并具有高度選擇性，分為E-、P-、L-選擇素三個成員。L-選擇素(或稱為CD62L)廣泛表達于多種白細胞，尤其是中性粒細胞，L-選擇素集中表達于未激活的中性粒細胞的微絨毛頂端或膜的皺折部位，這可能利于與其內皮細胞配體及早接觸[8]，是整合素介導中性粒細胞牢固黏附的前提，在炎癥反應的過程中起到重要的作用[9]。當創傷及炎性發生時，炎癥介質首先活化血管內皮細胞，使其表達黏附分子的相應配體，同時，L-選擇素表達量升高，并在創傷后24h內均處于高表達狀態[10];此時，血流中的白細胞通過其表面所表達的L-選擇素與其相應的內皮細胞配體結合，使原本在血流中隨機運動的白細胞在切應力的作用下沿炎癥附近血管緩慢滾動，這種“滾動”就是白細胞與內皮細胞牢固黏附的先決條件，而后隨著L-選擇素介導的細胞信號傳導的白細胞激活和β2整合素的粘附加強作用，使白細胞活化、變形，穿越血管內皮細胞到血管外，最終移行到炎癥區域釋放炎癥介質導致炎性反應造成組織纖維、壞死的等表現。因此，L-選擇素可作為白細胞參與創傷后反應的標志之一。國外學者研究證明[11]，通過阻止白細胞黏附，可顯著地減少白細胞對微循環機能和組織的損害，而L-選擇素介導白細胞的滾動、黏附與滲出[12]，位于損傷改變的始動環節，在創傷中有十分重要作用。同時，我們根據以往研究也已證實[13]，采用L-選擇素的拮抗劑可減輕組織炎癥癥狀，對缺血/再灌注損傷皮瓣起到一定得保護作用。因此使用一種可抑制或阻斷L-選擇素發揮作用，進而減少白細胞對組織的損害的藥物，可能對碾壓撕脫皮瓣起到一定的保護作用。

血管鈉肽(Vasonatrin peptide，VNP)，是一個人工合成的含有27個氨基酸(Aa)殘基組成的多肽，它是心房鈉尿肽(ANP)和C型鈉尿肽(CNP)的嵌合物，在生物活性上兼具CNP和ANP的雙重作用。國外的研究報道CNP可抑制白細胞動員并通過抑制P-選擇素的表達起到抑制白細胞貼壁滾動和血小板凝集的作用[14]，我們通過實驗證明了VNP也具有抑制P-選擇素表達的作用[3]。本實驗顯示，碾壓撕脫傷后早期給予VNP進行治療可同樣起到抑制L-選擇素表達的作用。與E-、P-選擇素不同，即使沒有刺激，白細胞表面也有少量L-選擇素表達，在細胞因子、炎性介質及其他因素的作用下，其表達的水平可發生變化，脫落是調節其活性的主要方式，而其反復脫落與再表達則影響著白細胞的趨化性[15]，故本研究中采用了平均積分光密度(IOD)這一客觀性較強的指標對其組化結果進行比較。實驗結果說明VNP可通過抑制L-選擇素的表達起到抑制白細胞的貼壁及滲出浸潤，減少血栓形成并減輕炎癥反應，同時減少白細胞對微循環機能和組織的損害，進而提高皮瓣的成活率，對碾壓撕脫皮瓣起到保護作用。此外，VNP是一種人工合成的多肽，體內可能缺乏特異性降解內肽酶，克服了其他鈉尿肽代謝快、半衰期短的缺陷。因此，VNP有希望成為防治碾壓撕脫皮瓣繼發壞死的多肽，可為臨床上提高碾壓撕脫皮瓣成活率并改善預后提供一種新的治療思路。

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[收稿日期]2009-12-02 [修回日期]2010-02-23

編輯/張惠娟