自制中藥醇提物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白\\基質(zhì)金屬蛋白酶1及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響

[摘要]目的:探討自制中藥醇提物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFB)Ⅰ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法:在體外培養(yǎng)KFB中加入500μg/ml自制中藥醇提物，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測KFB中Ⅰ型膠原蛋白、MMP-1及VEGF的表達(dá)。結(jié)果:在自制中藥醇提物的作用下，KFB中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)減弱，MMP-1表達(dá)增強(qiáng)，VEGF表達(dá)呈雙向性改變。結(jié)論:自制中藥可能通過影響KFB合成Ⅰ型膠原蛋白、MMP-1及VEGF而發(fā)揮治療瘢痕疙瘩的作用。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩;中醫(yī)藥;成纖維細(xì)胞;Ⅰ型膠原蛋白;基質(zhì)金屬蛋白酶1;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)03-0341-04

Effects of alcohol extractant from self-made traditional Chinese drug on expressions of typeⅠcollagen， matrix metalloproteinase 1 and vascular endothelial growth factor in keloid-derived fibroblasts

ZHAO Qing-li，MENG Ru-song，YANG Qing-qi，CAI Rui-kang

(Department of Dermatology，Air Force General Hospital of Chinese PLA，Beijing 100036，China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of the alcohol extractant from the self-made traditional Chinese drug on the expressions of typeⅠcollagen， matrix metalloproteinase 1 and vascular endothelial growth factor in keloid-derived fibroblasts(KFB).MethodsThe alcohol extractant from the self-made traditional Chinese drug at concentration of 500μg/ml was added to the cultured KFB. Immunohistochemistry was applied to detect the expressions of typeⅠcollagen， matrix metallo- proteinases 1 and vascular endothelial growth factor in KFB.ResultsAfter the extractant from drug taking action， the expression of type collagenⅠwas suppressed， the expression of MMP-1 was enhanced while the expression of VEGF was increased or decreased.ConclusionsThe self-made traditional Chinese drug may produce therapeutic effects by influencing the synthesis of typeⅠcollagen， MMP-1 and VEGF.

Key words:keloid， traditional Chinese drug; fibroblast， typeⅠcollagen; matrix metalloproteinase 1;vascular endothelial growth factor

瘢痕疙瘩(Keloid， K)的組織病理學(xué)特征為真皮中膠原纖維致密增生、排列紊亂。研究表明，K形成與膠原蛋白的合成與降解失衡有關(guān);K組織中的微血管狀況影響著K的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。Ⅰ型膠原蛋白是K膠原組織中的主要成分，基質(zhì)金屬蛋白酶1(Matrix Metalloproteinases 1， MMP-1)是降解Ⅰ型膠原蛋白的關(guān)鍵酶。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF)為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性絲裂原，在血管的形成、發(fā)育、分化等方面發(fā)揮著重要作用。本研究檢測自制中藥醇提物對K成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白、MMP-1及VEGF表達(dá)的影響，其目的是探討藥物的作用機(jī)制，為K臨床治療提供實(shí)驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1 材料:自制中藥由全蝎、蚤休、丹參、生乳香、浙貝母、生甘草組成。體外培養(yǎng)的人K成纖維細(xì)胞(Keloid Fibroblasts， KFB)6株、人正常皮膚成纖維細(xì)胞(Normal Fibroblasts， NFB)3株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院王春梅教授贈送。主要試劑及儀器包括兔抗人Ⅰ型膠原蛋白、MMP-1、VEGF多克隆抗體(武漢博士德公司)、二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、DMEM、新鮮小牛血清、正常羊血清、正常兔血清。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 藥物制備:90g自制中藥粉碎為細(xì)粉，加8倍量75%乙醇回流提取，濾過，濃縮，用乙醇溶解為100ml，密閉冷藏。量取適量的自制中藥醇提物水浴蒸干，加二甲基亞砜及PBS溶解，微孔濾膜濾過除菌，用細(xì)胞培養(yǎng)液(含DMEM、新鮮小牛血清、青霉素、鏈霉素)稀釋成實(shí)驗濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色:根據(jù)增殖實(shí)驗結(jié)果，選擇對成纖維細(xì)胞增殖無顯著抑制作用的藥物濃度(500 μg/ml)。KFB、NFB傳代3～7代，加0.25%胰蛋白酶消化，制成1.5×105/ml細(xì)胞懸液，以2ml/孔(3×105細(xì)胞/孔)加入內(nèi)含消毒蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)箱中孵育48h。吸除原培養(yǎng)液，中藥組加自制中藥醇提物培養(yǎng)液2ml于KFB孔中，陰性對照組加單純培養(yǎng)液2ml于KFB孔及NFB孔中，繼續(xù)孵育48h。取出蓋玻片，冷丙酮固定，1:15正常羊血清作用30min，分別滴加兔抗人Ⅰ型膠原蛋白(1:50)、MMP-1(1:100)、VEGF(1:50)多克隆抗體，同時設(shè)PBS對照及正常兔血清對照。4oC濕盒中過夜，復(fù)溫，滴加通用型IgG(Fab段)-HRP多聚體，37℃作用30min，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片。取硬皮病、惡性黑素細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜石蠟切片各1份，分別進(jìn)行Ⅰ型膠原蛋白、MMP-1、VEGF免疫組化染色，以此設(shè)為陽性對照。

1.2.3 結(jié)果判定:顯微鏡下觀察到Ⅰ型膠原蛋白、MMP-1、VEGF陽性表達(dá)呈棕褐色，細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核內(nèi)含棕褐色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。隨機(jī)計數(shù)5個高倍鏡視野(×400)中細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，并換算成陽性細(xì)胞百分計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析:將所有資料輸入數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，檢測指標(biāo)用x±s表示，統(tǒng)計分析方法為t檢驗。P<0.05定義為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

硬皮病真皮網(wǎng)狀層可見Ⅰ型膠原蛋白呈片狀棕褐色著色。惡性黑色素瘤胞漿、核質(zhì)中見MMP-1呈顆粒狀棕褐色著色。子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)見VEGF呈彌漫性棕褐色著色。PBS對照及正常兔血清對照均未見棕褐色著色。

2.1成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá):陰性對照組KFB(圖1)、NFB及中藥組KFB(圖2)均見胞核核膜上呈線狀及核質(zhì)中呈核仁樣分布的較多Ⅰ型膠原蛋白陽性顆粒。陰性對照組KFB胞漿中見大量散在分布的陽性顆粒，陰性對照組NFB及中藥組KFB胞漿中僅見少數(shù)散在的陽性顆粒。胞漿中陽性顆粒的表達(dá)強(qiáng)度為:陰性對照組KFB>中藥組KFB≌陰性對照組NFB。陽性細(xì)胞百分計數(shù)在陰性對照組KFB與NFB間、陰性對照組與中藥組KFB間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.2 成纖維細(xì)胞MMP-1表達(dá):三組MMP-1陽性表達(dá)均以胞核為主。陰性對照組KFB(圖3)多數(shù)胞核呈陰性反應(yīng)，少數(shù)胞核中見陽性細(xì)顆粒、粗顆粒排列于核周或/及散在分布于核質(zhì)中;陰性對照組NFB及中藥組KFB(圖4)多數(shù)胞核呈陽性反應(yīng)，陽性顆粒粗大甚至呈團(tuán)塊狀，散在分布于核質(zhì)中或聚集于核質(zhì)的一側(cè)。陰性對照組KFB胞漿中陽性顆粒少見，陰性對照組NFB及中藥組KFB胞漿中均見少數(shù)散在分布的陽性顆粒。陽性顆粒的表達(dá)強(qiáng)度為:中藥組KFB≌陰性對照組NFB>陰性對照組KFB。陰性對照組KFB的陽性細(xì)胞百分計數(shù)低于陰性對照組NFB，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);陰性對照組與中藥組KFB間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (表1)。 2.3 成纖維細(xì)胞VEGF的表達(dá):陰性對照組KFB(圖5)、NFB多數(shù)胞核、胞漿中均見VEGF陽性顆粒，呈細(xì)顆粒、粗顆粒狀散在分布于核質(zhì)中或/及胞漿中，以胞核為主。中藥組KFB(圖6A 6B)部分細(xì)胞陽性表達(dá)減弱，表現(xiàn)為胞核中少數(shù)散在的核仁樣顆粒，胞漿中呈陰性反應(yīng)或僅見少數(shù)散在的陽性細(xì)顆粒;部分細(xì)胞陽性表達(dá)增強(qiáng)，表現(xiàn)為胞漿中大量散在分布的陽性粗顆粒，或大量陽性細(xì)顆粒聚集于核周。陽性顆粒的表達(dá)強(qiáng)度為:中藥組KFB表達(dá)增強(qiáng)區(qū)>陰性對照組KFB≌陰性對照組NFB>中藥組KFB表達(dá)減弱區(qū)。中藥組KFB的陽性細(xì)胞百分計數(shù)低于陰性對照組KFB，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);陰性對照組KFB與NFB間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)(表1)。

3討論

K組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的含量明顯增加，尤以Ⅰ型膠原為甚。Ⅰ型膠原蛋白的合成受諸多因素影響，直接檢測體外培養(yǎng)的KFBⅠ型膠原蛋白的表達(dá)可以避免許多內(nèi)在因素的干擾，顯現(xiàn)KFB本身所固有的特性。為了能準(zhǔn)確地判定自制中藥醇提物對成纖維細(xì)胞合成Ⅰ型膠原蛋白的影響，避免藥物抑制細(xì)胞增殖的干預(yù)，本研究選擇對成纖維細(xì)胞增殖無顯著抑制作用的藥物濃度。我們的結(jié)果表明，KFB合成Ⅰ型膠原蛋白增加，表現(xiàn)為胞漿中有大量的陽性顆粒;自制中藥醇提物可抑制KFB合成Ⅰ型膠原蛋白，表現(xiàn)為胞漿中陽性顆粒明顯減少。然而，陽性細(xì)胞百分計數(shù)分析并未顯示陰性對照組KFB與NFB間、陰性對照組與中藥組KFB間統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，我們認(rèn)為這可能與三組成纖維細(xì)胞胞核上陽性表達(dá)無數(shù)量上的差異有關(guān)。

近年來，膠原蛋白合成與降解間的失衡在K形成中的作用引起國內(nèi)外學(xué)者的重視。關(guān)于K組織細(xì)胞中MMP家族的檢測與干預(yù)已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)課題。MMP家族是一組蛋白水解酶類，它們對細(xì)胞外基質(zhì)具有廣泛的降解作用。MMP-1為其家族成員之一，它可以在Ⅰ型前膠原α1、α2鏈的特殊位點(diǎn)降解膠原，使其成為1/4～3/4片段。在創(chuàng)傷修復(fù)中MMP-1可表達(dá)于真皮成纖維細(xì)胞上，以參與肉芽組織的形成和清除以及瘢痕的消退[1]。國內(nèi)有學(xué)者對K病理切片進(jìn)行MMP-1免疫組化染色，結(jié)果顯示K組織中MMP-1表達(dá)較正常皮膚顯著增加[2]。鑒于成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞均可產(chǎn)生MMP-1，我們認(rèn)為檢測K組織中MMP-1的表達(dá)并不能反映出成纖維細(xì)胞合成MMP-1的實(shí)際狀況。本研究的MMP-1定性、定量分析結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的KFB與NFB比較，其MMP-1表達(dá)顯著降低，此結(jié)果與Arakawa等[3]、Uchida等[4]結(jié)論相符，提示KFB自身存在著MMP-1轉(zhuǎn)錄及/或翻譯水平的異常，致使KFB胞核、胞漿中MMP-1蛋白減少。在我們的臨床療效觀察中發(fā)現(xiàn)，自制中藥軟膏可使K萎縮、變平、退化(待發(fā)表)。本研究顯示自制中藥醇提物可使KFB中MMP-1蛋白增多，這表明本藥物可能通過促進(jìn)KFB合成MMP-1、以降解致密增生的膠原纖維，從而達(dá)到促使K消退的治療效果。

關(guān)于K微血管狀況在K發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中的作用已成為近年來學(xué)術(shù)界爭論的焦點(diǎn)之一。部分學(xué)者強(qiáng)調(diào)，瘢痕組織血管生成過多、血供豐富支撐著瘢痕的過度增生。另有學(xué)者認(rèn)為，瘢痕組織供血不足、組織缺氧誘發(fā)K;瘢痕內(nèi)血管通路的建立、正常微循環(huán)的形成對瘢痕的退化有促進(jìn)作用[5-6]。新近的研究表明，K部位不同，組織內(nèi)微血管狀況亦不同;浸潤部微血管數(shù)量增加，老化部微血管數(shù)量減少[7]。多數(shù)文獻(xiàn)支持K組織中VEGF表達(dá)增高[7-10]，其主要分布或真皮成纖維細(xì)胞上[7-8，10]，或表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中[9];VEGF表達(dá)K浸潤部>K周邊正常皮膚≌K增生部>K老化部≌正常人皮膚[10]。由此可見，對于臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣的K皮損而言，單純地促使或抑制血管增生均欠全面，須根據(jù)K皮損的不同表現(xiàn)分別采取相應(yīng)的治療。本研究結(jié)果顯示，在培養(yǎng)液中生長的KFB其VEGF表達(dá)與NFB比較無明顯差異，即KFB就單個細(xì)胞而言無VEGF合成增多。我們推測以往學(xué)者檢測到的KFB上VEGF高表達(dá)可能與組織中的微環(huán)境及相關(guān)因子的作用有關(guān)，或與組織中KFB增多有關(guān)。KFB在自制中藥醇提物的作用下，雖與陰性對照組比較其VEGF陽性細(xì)胞百分計數(shù)顯著減少，但卻同時顯現(xiàn)VEGF表達(dá)明顯減弱及顯著增強(qiáng)，即表明該藥物對KFB VEGF的合成具有雙向調(diào)節(jié)作用，可使部分KFB合成VEGF增多而部分KFB合成VEGF減少，這是否意味著K組織中存在著具有不同VEGF合成機(jī)制的成纖維細(xì)胞，是否意味著調(diào)動成纖維細(xì)胞的這種雙向反應(yīng)以促進(jìn)及抑制血管增生對K的治療更有益，尚需要進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2009-11-21 [修回日期]2010-02-06

編輯/張惠娟