表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對小鼠脫發模型毛發生長的影響

[摘要]目的:觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對C57BL6小鼠脫發模型毛發生長及毛發周期的影響。方法:采用松香、蠟脫毛法誘導小鼠體毛由休止期進入生長期。脫毛次日分組，各組小鼠每日分別以8%EGCG乙醇制劑、5%米諾地爾溶液、乙醇涂擦脫毛區，連續21天，記錄小鼠皮膚顏色變化過程及新生毛發生長狀況，并通過HE切片觀察EGCG對皮膚、毛囊形態，毛囊數目的影響。結果:與陰性對照組相比，實驗組和陽性對照組提前24h由粉紅變為紅色、推遲48h由黑色變為灰色，而基質組與陰性對照組無明顯差別;實驗組和陽性對照組小鼠毛囊數目在統計學上均與陰性對照組小鼠具有顯著性差異。結論:EGCG可誘導小鼠毛囊進入生長期，延長生長期時間，推遲進入退行期，并刺激小鼠毛囊數目增多。

[關鍵詞]EGCG;C57BL6小鼠;毛發周期;毛囊

[中圖分類號]R758.71[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)03-0350-03

Effects of EGCG on hair growth of C57BL6 mouse alopecia model

LI Da-ning，LI Mei-yun，LIU Jin-fen，FENG Xin-qing，SHI Yu

(Dermatology Department of Xuhui Central Hospital， Shanghai200031，China)

AbstractObjectiveTo observe the effects of EGCG on hair growth and hair cycle of C57BL6 mouse alopecia model.MethodsWe induced back hair of mice from anagen to telogen by depilation of hair shafts with wax∶resin (1∶1) mixture. The mice were treated tropically once a day respectively using 8% EGCG， 5% minoxidil solution and alcohol for 21 days， meanwhile the changes of skin color and new hair growth characteristic were observed daily. Furthermore，the effects of EGCG on skin， hair follicle morphology and the number of hair follicles were evaluated by HE slice.ResultsCompared with the negative control group， the back skin color of the experimental group and the positive control group turned from pink to black 24h earlier and gray from black delay 48h， while the matrix liquid group and the negative control group have no significant differences. There are significant differences in experimental group， the positive control group and the negative control group on the number of hair follicles.ConclusionEGCG not only can induce and prolong anagen， but also postpone catagen in C57BL6 mice. Moreover， EGCG can stimulate an increase in the number of hair follicles in mice.

Key words: EGCG; C57BL6 mice; hair cycle; follicles

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate， EGCG)是綠茶提取物茶多酚中的一種主要活性單體，具有廣泛的生物學活性。為了探討EGCG與毛發生長的關系，筆者以C57BL6小鼠作為動物模型，觀察EGCG對小鼠脫發模型毛發生長及毛發周期的影響。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:C57BL 6 小鼠，雌性，8 周，15～20g，同系，共24只，中國科學院藥物研究所動物中心提供。選擇皮色粉紅，毛發屬于休止期的小鼠。C57BL6小鼠的毛發周期同步，可根據其皮膚顏色判斷毛發周期的階段變化，毛發生長期皮膚呈黑色，退行期呈灰色，休止期呈粉紅色[1]。

1.1.2 主要試劑:EGCG購于美國Sigma公司，貨號E4143;5%米諾地爾溶液(商品名:蔓迪)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脫發模型建立:將松香與石蠟1:1混合加熱融化后，均勻涂于小鼠背部，涂抹面積約2cm×3cm，冷卻凝固后揭去，以去除背毛。確認毛發生長期處于休止期。

1.2.2 動物分組:脫毛次日，選取脫毛區光滑無皮膚破損的小鼠，隨機分為4組，每組動物數6只。分別是:①實驗組:給予8%EGCG乙醇制劑;②陽性對照組:給予5%米諾地爾溶液;③基質組:給予基質液(乙醇);④陰性對照組:不涂抹藥物。

1.2.3 給藥:局部皮膚直接用棉簽涂抹給藥，每天定時給藥1次，每次給藥量為0.1ml，連續給藥20天。

1.2.4 觀察記錄結果:每天觀察小鼠皮膚及毛色變化，記錄每只動物背部去毛區皮膚顏色從涂藥到開始變黑的時間;陰性對照組記錄脫毛后第1天到開始去毛區皮膚變黑的時間;去毛區開始變黑到長滿毛的時間，并定期拍照。

第4、12、20天時，取各組小鼠背部相同位置皮膚組織塊，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，切片厚約4～5μm，HE染色，光鏡下觀察。觀察指標如下:①一般組織學檢查:觀察皮膚完整性，有無充血、水腫、炎細胞浸潤等反應及程度;②毛囊計數，每例數3個高倍視野(×400)的毛囊數，取其均值，并進行統計學處理。

1.2.5 統計學分析:采用SPSS.11統計軟件進行兩樣本均數的t檢驗。

2結果

2.1 EGCG對毛發生長周期的影響:①實驗組小鼠在拔毛后第5～6天局部皮膚逐漸出現黑色，毛發進入生長期，10天后新的毛發長出，20天時皮膚顏色又經灰色(退行期)變為粉紅色(休止期)，皮膚黑色及灰色共持續約15天;②陽性對照組小鼠在拔毛后第5天局部皮膚漸出現黑色，毛發進入生長期，9天后新的毛發長出，20天時皮膚顏色又經灰色(退行期)變為粉紅色(休止期)，皮膚黑色及灰色共持續15天;③基質組、陰性對照組小鼠均在拔毛后第6天局部皮膚由粉紅色變為黑色，10天后新的毛發長出，19天時皮膚顏色又經灰色變為粉紅色，皮膚黑色及灰色共持續13天。

2.2 組織學檢查

2.2.1 實驗第4天時，切取每組小鼠背部皮膚，可觀察到實驗組和陽性對照組皮下血管網豐富，血管較粗;而基質組和陰性對照組未見此現象，見圖1。

2.2.2 實驗第12、20天，切取每組小鼠背部皮膚，石蠟切片，HE染色觀察到:各組小鼠皮膚結構均完整，被覆鱗狀上皮完整，角化層無增厚，真皮內無炎細胞浸潤。實驗組和陽性對照組動物皮膚毛囊發育較完整，數量較多，黑素較基質組和陰性對照組明顯。各組毛囊形態無明顯差異，見圖2。

2.3 EGCG對毛囊密度的影響:實驗第20天，各組小鼠毛囊數目見表1。實驗組、陽性對照組與陰性對照組小鼠在統計學上均具有極顯著性差異，P<0.001， 基質組與陰性對照組相比無顯著性差異，P>0.05。且實驗組與陽性對照組相比較無顯著性差異，P>0.05。

3討論

EGCG是綠茶提取物茶多酚中的一種主要活性單體，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、調節機體免疫及誘導腫瘤細胞凋亡等作用[2]。研究發現，EGCG對多種腫瘤細胞增殖表現不同程度的抑制作用，其機制與誘導腫瘤細胞凋亡，誘導腫瘤細胞周期阻滯，對細胞信號傳導通路的影響等有關[3]。也有報道顯示EGCG對正常的表皮角質形成細胞有促增殖作用[4]。2006年Kwon 等[5]首次報道了EGCG可促進人毛發生長。國內李梅云、范衛新等[6]研究也發現一定濃度的EGCG可促進體外培養的人毛囊生長和毛乳頭細胞增殖。目前國內外未見EGCG對毛發生長周期影響的相關報道。本研究以C57BL6小鼠為模型，設立陽性對照、陰性對照，觀察外用EGCG溶液對毛發周期、毛囊密度、毛囊形態的影響。

C57BL6小鼠是研究毛發周期的動物模型，毛發呈周期性生長，毛發周期分生長期、退行期和休止期。。該小鼠毛發呈黑色，皮膚中的黑素細胞均分布于毛囊，僅在毛發生長期才合成分泌黑素，并將黑素傳遞給角質形成細胞，使皮膚呈黑色;在毛發退行期，黑素合成減少，皮膚逐漸由黑色變為灰色;休止期無黑素合成，皮膚呈粉紅色。經組織學驗證，該小鼠皮膚顏色的變化能反映毛發生長周期的不同時段。該小鼠在6～8周飼養良好狀態下，所有毛囊均由生長期(皮膚黑色)進入休止期(皮膚粉色)狀態，而且在生理狀態下不再自發進入生長期，但經人為拔毛后可被誘導進入生長期，拔毛后第5～6天 皮膚顏色變黑(生長期第Ⅳ亞期)，黑色持續12天又轉為灰色(退行期)，2天后皮膚轉為粉紅色(休止期)[7]。

米諾地爾溶液是臨床應用極為廣泛的一種治療各類脫發的藥物，有研究表明，其可以使毛發提前進入生長期，延長生長期時間，并縮短休止期，并能使毛囊增大[8]。故本研究選用5%米諾地爾溶液為陽性對照。

本實驗發現，與陰性對照組小鼠相比，實驗組小鼠皮膚顏色提前 24h由粉紅色變為黑色，推遲24h由黑色變為灰色，毛囊生長期時間較陰性對照組長近72h，表現與陽性對照組結果相似。提示EGCG與米諾地爾一致，可誘導毛囊進入生長期，延長生長期時間，并推遲進入退行期。我們還發現，實驗第4天時，切取每組小鼠背部皮膚，觀察到實驗組和陽性對照組皮下血管網豐富，血管較粗;而基質組和陰性對照組未見此現象。推測EGCG和米諾地爾一樣具有促進血管增生的作用。同時在實驗第20天，我們觀察到實驗組、陽性對照組與陰性對照組小鼠毛囊數目，在統計學上均具有極顯著性差異，P<0.001;基質組與陰性對照組相比無顯著性差異，P>0.05;實驗組與陽性對照組相比較無顯著性差異，P>0.05。由此可見EGCG具有促進毛囊生長的作用，且此作用與米諾地爾相當。

本研究結果顯示EGCG可誘導C57BL6毛囊進入生長期，延長生長期時間，并推遲進入退行期，具有促進毛囊生長的作用，可能與其促進血管增生作用有關。國內外均有研究發現EGCG可促進人毛發及體外培養的毛囊生長和體外培養的毛乳頭細胞增殖。但人與動物有著種屬差異，故EGCG促進毛發生長作用的機制有待進一步的研究。

[參考文獻]

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[3]Ahmad N，Cheng P，Mukhtar H. Cell cycle dysregulation by green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate[J]. Biochem Biophys Res Commun，2000， 28，275(2):328-334.

[4]Hsu S，Bollag WB，Lewis J，et al. Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes[J]. J Pharmacol Exp Ther，2003，306(1):29-34. Epub 2003 Mar 27.

[5]Kwon OS，Han JH，Yoo HG. Human hair growth enhancement in vitro by green tea epigallocatechin-3-gallate (EGCG) [J]. Phytomedicine，2007，14(7-8):551-555.

[6]李梅云，范衛新，周乃慧. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對體外培養的人毛囊生長和毛乳頭細胞增殖的影響[J].中華皮膚科雜志，2008，41(2):173-175.

[7]Paus R，Hofmann U，Eichmuller S，et al. Distribution and changing density of gammadelta T cells in murine skin during the induced hair cycle[J]. Br J Dermatol，1994，130: 281.

[8]Tu Jun-Bo，Yang Zhuang-Qun， He Xi-Jing， et al. Effect of ethosomal minoxidil on dermal delivery and hair cycle of C57BL/6 mice[J]. J Dermatolog Sci，2007，45:135-137.

[收稿日期]2009-11-12 [修回日期]2010-02-03

編輯/張惠娟