內質網分子伴侶GRP94\\GRP78和XBP1在病理性瘢痕中的表達初探

[摘要]目的:檢測內質網應激反應的關鍵分子葡萄糖調節蛋白94(GRP94)、葡萄糖調節蛋白78(GRP78)和X-盒結合蛋白1(XBP1)mRNA在病理性瘢痕的表達，探討其基因表達及內質網應激反應與病理性瘢痕形成及轉歸的關系。方法:用RT-PCR法檢測GRP94、GRP78和XBP1 mRNA在:①瘢痕疙瘩(13例)、增生性瘢痕(17例)和正常皮膚(15例)組織以及體外培養的瘢痕疙瘩(5例)、增生性瘢痕(5例)和正常皮膚(6例)成纖維細胞中的表達;②體外培養瘢痕疙瘩和增生性瘢痕成纖維細胞(各5例)中經0.1mg/ml氫化可的松作用前后的表達。結果:①GRP94、GRP78和XBP1 mRNA在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮膚組織及其成纖維細胞中的表達均無顯著性差異(P>0.05);②0.1mg/ml氫化可的松作用后，GRP94 mRNA在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕來源的成纖維細胞中的表達量均顯著下降，具有統計學意義(P<0.01);而GRP78和XBP1mRNA在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕來源的成纖維細胞中的表達量改變均無顯著性差異(P>0.05)。結論:內質網分子伴侶GRP94、GRP78和XBP1在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕組織及其成纖維細胞中基因轉錄與正常皮膚組織及其成纖維細胞中基因轉錄水平一致; GRP94 mRNA的表達量顯著下降可能是糖皮質激素治療病理性瘢痕的機制之一。

[關鍵詞]葡萄糖調節蛋白94;葡萄糖調節蛋白78;X-盒結合蛋白1;瘢痕

[中圖分類號]Q591.2[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)03-0358-03

A preliminary study on the expression of endoplasmic reticulum chaperone GRP94、GRP78 and XBP1 in pathologic scar

NIE Fang-fei，QIN Ze-lian，CHEN Dong-ming，ZHAO Xia

(Department of Plastic Surgery，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China)

Abstract: ObjectiveTo detect the expression of glucose regulated protein 94(GRP94)，glucose regulated protein 78(GRP78) and X-box binding protein 1(XBP1)， which are key molecules in endoplasmic reticulum stress，in pathologic scar，and to explore the association between their expression and pathologic scar. Methods The samples consisted of three kinds of tissues，which were keloid，hypertrophic scar and normal skin. Fibroblasts were derived from the samples and cultured in vitro.Hydrocortisone in 0.1mg/ml concerntration was administrated to the fibroblasts derived from keloid and hypertrophic scar. RT-PCR was used to assess the mRNA expression levels of the aimed genes in tissue samples and fibroblasts.Results No significant differences were detected on GRP94，GRP78 or XBP1 mRNA levels in tissues or fibroblasts among the three groups: keloid，hypertrophic scar and normal skin.GRP94 mRNA levels were lessened remarkably in each fibroblast sample after being treated with hydrocortisone，while the changes of GRP78 and XBP1 mRNA levels were irregular.ConclusionsThere are no significant differences in GRP94、GRP78 or XBP1 mRNA levels among keloid， hypertrophic scar and normal skin tissues or fibroblasts. Downregulation of GRP94 mRNA expression may be one of the mechanisms for glucocorticoid hormones to treat pathologic scar.

Key words: glucose regulated protein 94; glucose regulated protein 78; X-box binding protein 1; scar

病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩和增生性瘢痕，是整形外科面臨的難題之一。以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征，其發病機制與免疫、炎癥、細胞增殖/凋亡失衡等多種因素相關[1]。研究表明，病理性瘢痕局部可能存在缺氧、氧自由基、鈣離子失衡、內質網中分泌蛋白超負荷等微環境因素[2-3]。而細胞內鈣失穩態、大量氧自由基和未折疊或錯誤折疊蛋白質在內質網的蓄積可以引發內質網應激， 其標志為內質網分子伴侶葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78， GRP78)、葡萄糖調節蛋白94(glucose regulated protein 94， GRP94)等的轉錄上調和X-盒結合蛋白1(X-box binding protein 1， XBP1)mRNA的剪切等[4]。內質網分子伴侶還參與了內質網中蛋白質的合成和分泌;與免疫、炎癥和細胞凋亡等細胞生物學行為關系密切[5-7]，因此，筆者推測病理性瘢痕組織局部可能存在內質網應激反應。本實驗檢測病理性瘢痕組織及其來源的成纖維細胞中內質網分子伴侶GRP94、GRP78和XBP1 mRNA的表達，有助于明確內質網應激以及上述內質網分子伴侶與病理性瘢痕發病及轉歸機制的聯系。

1材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗標本:所用標本主要來自北京大學第三醫院成形外科門診及病房手術的患者，少數來自北京積水潭醫院燒傷整形科患者。瘢痕標本為切除的病變組織，正常皮膚為美容手術或植皮術棄用的皮膚。所有取材均獲得患者知情同意。組織標本在離體后切成小塊，液氮凍存;或立即置于培養液中用于細胞培養。

1.1.2 主要試劑及儀器:DMEM培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國HyClone公司)、氫化可的松注射液(北京雙鶴藥業股份有限公司)、焦碳酸二乙酯(DEPC，美國Sigma公司)、組織及細胞RNA提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒(北京博大泰克生物基因技術有限責任公司)。凝膠成像及分析系統(英國Syngene公司)。

1.1.3 基因引物:目的基因及內參基因GAPDH 的引物序列均引自文獻[8-10]， 由上海生工生物工程公司合成。引物序列分別是:GRP94上游5′- CAG TTT TGG ATC TTG CTG TGG -3′，GRP94下游5′- CAG CTG TAG ATT CCT TTG C -3′， 擴增片段長度為270bp;GRP78上游5′- CTG GGT ACA TTT GAT CTG ACT GG -3′，GRP78下游5′- GCA TCA TGG TGG CTT TCC AGC CAT TC -3′，擴增片段長度為398bp;XBP1上游5′- CCT TGT GTA GTT GAG AAC CAG G -3′，XBP1下游5′- GGG GCT TGG TAT ATA TGT GG -3′，擴增片段長度為442bp(mRNA被剪切前)或416bp(mRNA被剪切后);GAPDH上游5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT CA-3′，GAPDH下游5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′，擴增片段長度為250bp。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及處理:采用組織塊培養法進行成纖維細胞的原代培養。待細胞幾乎長滿成致密單層后，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代。實驗所用成纖維細胞為第2～5代細胞。

細胞約80%融合時給予氫化可的松，同時設未給藥組;96h后，提取細胞總RNA。

1.2.2 RT-PCR法檢測目的基因的表達量:取適量液氮凍存的組織，提取總RNA;每例細胞標本取2×106個成纖維細胞，加1mlTrizol 試劑提取細胞總RNA。取等量的RNA，反轉錄成cDNA，加入PCR試劑進行PCR反應，取8μl PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統掃描凝膠中各條帶紫外光吸收量(Vol)。目的基因Vol值與相應內參Vol值的比值代表每個樣本目的基因的相對表達量。

1.3 統計學處理:采用SPSS11.0統計學軟件分析，所有數據以均數±標準差表示。以單因素方差分析(ANOVA)檢驗三組間差異;以配對t檢驗分析給藥細胞與對照細胞的基因表達差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 目的基因GRP94、GRP78和XBP1的PCR產物:所有的PCR產物電泳圖中只有特異片段大小的單一條帶，經測序證實為目的基因序列，且未發現XBP1有剪切后片段。

2.2 瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮膚三組組織及其來源成纖維細胞中目的基因GRP94、GRP78和XBP1的表達:每個基因在三組間的表達量差異均無統計學意義(表1)。

2.3 氫化可的松對瘢痕疙瘩和增生性瘢痕組織來源的成纖維細胞中GRP94、GRP78和XBP1表達的影響:經氫化可的松處理后，在被培養的每一例病理性瘢痕來源的成纖維細胞中，GRP94的表達量均明顯下降，經數據分析，處理前后的數值改變具有統計學意義(P<0.01)(表2)。而GRP78和XBP1mRNA的表達量改變則未顯示出明顯的規律。

3討論

研究表明，病理性瘢痕成纖維細胞處于過度增殖狀態，多種抗凋亡基因表達增高，促凋亡基因表達減少[2]。據文獻[11]報道，被內質網應激誘導的內質網分子伴侶GRP94、GRP78和XBP1高水平表達時具有抗凋亡作用。因此，病理性瘢痕中這些基因的表達可能增高。但是，本實驗結果初步提示瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮膚組織及其來源的三組成纖維細胞中GRP94、GRP78和XBP1的mRNA表達量無顯著性差異。而GRP94蛋白在病理性瘢痕組織中的表達高于正常皮膚組織[12-13]，提示在無外來藥物等因素干預的狀態下，GRP94分子可能存在著基因與蛋白表達量不一致的現象。由于GRP94能與細胞內大量多肽非共價結合，在細胞存活以及細胞分化等方面都發揮著重要的作用。大量研究是關于GRP94與腫瘤發生的。據文獻報道，雖然研究表明在很多應激誘導條件下，GRP94常與分子伴侶GRP78協同發揮作用。但同時也有許多研究證據表明兩者在蛋白水平并不總是與轉錄水平保持一致;而且在不同的腫瘤以及同類腫瘤的不同分期，這兩個分子的表達水平并不統一。可見分子伴侶的作用機制是復雜的。但總體來講，GRP94在腫瘤發生中的作用是不可替代的，癌細胞與非癌細胞相比，在應激條件下GRP94的表達水平明顯增高，而且高侵襲力細胞株比低侵襲力細胞株更高[14]。類似的，已有的實驗結果提示了大量GRP94蛋白的合成能夠幫助病理性瘢痕的成纖維細胞過度增殖和分泌大量的膠原纖維。

XBP1是內質網應激中另一個重要的轉錄因子，剪切后的XBP1mRNA可編碼新的XBP1蛋白，該蛋白是具有活性的轉錄因子，能促進自身基因的轉錄及內質網應激相關的其他靶基因(包括GRP94和GRP78等)的轉錄。但是本實驗所檢測的組織及細胞中均未發現有XBP1剪切后的片段。據此，病理性瘢痕中存在的應激因素是否使成纖維細胞處于內質網應激狀態還有待于進一步的實驗研究。GRP94蛋白在病理性瘢痕表達上調可能是通過內質網應激以外的其它途徑實現的。

本實驗結果還顯示，每例被培養的病理性瘢痕來源的成纖維細胞經糖皮質激素氫化可的松處理后GRP94 mRNA的表達量均顯著下降，處理前后的數值改變具有統計學意義。這與經糖皮質激素曲安奈德作用后，人增生性瘢痕移植裸鼠的模型中GRP94蛋白表達陽性的成纖維細胞數顯著減少的研究結果[13]一致。結合GRP94蛋白在病理性瘢痕組織的成纖維細胞中高表達的研究結果[12-13]，提示糖皮質激素通過調節mRNA水平上GRP94的表達量，進而調節其蛋白表達量，起到抑制成纖維細胞增殖，治療瘢痕過度增生的作用。

結合以往的實驗結果，本研究提示:GRP94分子與病理性瘢痕的發生和治療機制有一定的聯系;病理性瘢痕組織及其成纖維細胞中似乎并未發生明顯的內質網應激反應，更確切的結論尚需要更深入細致的研究。

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[收稿日期]2009-10-26[修回日期]2010-01-29

編輯/張惠娟