UVA1照射對人工皮膚分泌MMP-1影響的初步研究

[摘要]目的:探討不同UVA1劑量照射對人工皮膚分泌MMP-1的影響，明確光致人工皮膚損傷的UVA1劑量。方法:通過ELISA法檢測不同劑量的UVA1(0～90J/cm2)對人工皮膚表達MMP-1分泌的變化。結果:與0J/cm2相比，UVA1劑量為10J/cm2時MMP-1的分泌量無明顯變化(P>0.05)，當UVA1劑量大于20J/cm2時人工皮膚分泌MMP-1的量逐漸增高(P<0.05，P<0.0001)，UVA1劑量在小于50J/cm2以前呈劑量依賴性增高，至70J/cm2以后分泌量較前有所降低。結論:引起人工皮膚光損傷的初始UVA1照射劑量為20J/cm2。

[關鍵詞]長波寬譜紫外線(UVA1);人工皮膚;基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)03-0348-03

The preliminary study of the MMP-1 secretion in artificial skin in different dose of UVA1

SUN Su-jiao1，2，YAO Lu1，LUO Wen1，SU Shun-qin1，XU Ji-peng1，YNAG Zhi1，HE Li1

(1.Department of Dermatology， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College， Kunming 650032，Yunnan，China; 2.Department of Cosmetology， the Affiliated Hospital of Dali College， Dali671000，Yunnan， China)

Abstract:Objective To explored the different dose ofUVA1 irradiation on artificial skin secretion of MMP-1， clearly the UVA1 dose oflight-induced damage in artificial skin. MethodsThe ELISA assay was used to measure the changes of secretion of MMP-1 after different doses of UVA1 exposure(0J/cm2～90J/cm2).ResultsCompared to dose of 0J/cm2， the secretion of MMP-1 of UVA1 dose of 10J/cm2 has no significant difference(P>0.05). When the UVA1 doses greater than 20J/cm2， the secretion of MMP-1 in artificial skin was gradually increased (P<0.05， P<0.0001). The previous dose-dependent increase when UVA1 dose was less than 50J/cm2， but the secretion of MMP-1 was decreased when the dosage up to 70J/cm2.ConclusionThe results shows that the initial dose of the artificial skin photodamage caused by UVA1 radiation is 20J/cm2.

Key words:long-wave wide-spectrum ultraviolet (UVA1);artificial skin;matrix metalloproteinase -1 (MMP-1)

近年來長波寬譜紫外線UVA1(340～400nm)對皮膚的光損傷越來越受到人們的重視，因為UVA1是紫外線中波長最長的一個波段，紫外線的波長越長對皮膚組織的穿透越深。UVA1的主要效應部位是皮膚真皮層，真皮層主要的細胞是成纖維細胞，一些實驗證實真皮成纖維細胞產生的基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP-1)與UVA引起的光損傷最為相關[1-2]。本實驗應用人工皮膚，力求在一個模擬的更加接近正常人皮膚細胞環境的條件下，應用對皮膚穿透力更強的UVA1照射人工皮膚，觀察不同UVA1照射劑量下人工皮膚損傷的情況，通過檢測MMP-1的分泌量間接反應人工皮膚特別是真皮的損傷情況。

1材料和方法

1.1 標本來源:人工皮膚購買自陜西艾爾膚公司，產品編號:國食藥監械(準)字2007第3461110號。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑和材料:MMP-1ELISA試劑盒(ADL公司)，無因子角質形成細胞培養基K-SFM(美國Gibco公司)，35mm培養皿(Coring 公司)。

1.2.2 儀器:SUV-1000日光紫外線模擬器和輻照計(上海Sigma公司)，酶標儀(EL×800/Bio-tek)，CO2恒溫孵育箱(德國Sigma公司)，OLYMPUS BX-50F4顯微鏡。

1.3 方法步驟

1.3.1 紫外線照射:UVA1劑量=UVA1輻照度×時間(秒)，應用上海SIGMA高技術有限公司UVA1輻照度監示器標定SUV-1000日光紫外線模擬器的輻照度。照射時培養皿蓋著蓋子，在計算強度時應減去培養皿蓋衰減的強度。照射時每個培養皿加0.3mlPBS液防止組織變干，照射完畢后用PBS液清洗組織塊3次。

1.3.2ELISA法檢測MMP-1分泌量:在超凈臺內配合不銹鋼標尺將人工皮膚用手術刀和剪刀分割成5mm×5mm大小移入35mm培養皿中，UVA1照射劑量分組為0J/cm2、10J/cm2、20cm2、30J/cm2、40J/cm2、50J/cm2、70J/cm2、90J/cm2，每組設3個平行孔，照射后將皮片移入24孔板中標號，加入K-SFM培養基0.5ml，至氣液界面繼續培養24h后行ELISA檢測。

1.4 統計分析:實驗資料以(x±s)表示，采用Spss13.0統計分析軟件中的Student's-t檢驗對實驗數據進行統計分析， P<0.05為差異具有統計學意義。

從表1和圖1中可知，當UVA1照射強度為10J/cm2時，人工皮膚分泌MMP-1與0J/cm2比較變化不明顯。隨著紫外照射強度的增加，人工皮膚分泌MMP-1逐漸增加，當UVA1照射強度為20J/cm2時，與0J/m2比較差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.001)。當UVA1照射強度增至70J/cm2及90J/cm2時，人工皮膚分泌MMP-1較前有所降低，但與0J/m2比較，差異仍具有統計學差異(P<0.001)。

在以往光損傷的研究中，單層細胞培養、動物實驗和正常人皮膚研究光損傷較為多見。但單層細胞的培養無法模擬機體的三維環境，特別是無法模擬光損傷時的穿透性，而動物與人由于種屬不同而存在差異，此外應用正常人皮膚由于涉及來源和倫理問題，也較難開展。人工皮膚的出現為許多相關的研究開創了新的道路，因為它在更大程度上模擬了人體的三維環境。人工皮膚構建工藝固定、性質穩定、應用范圍廣、一致性強，得到的實驗結果更具有說服力。更重要的是人工皮膚中含有來源于人并能夠代謝的活細胞，因而能夠更好地模擬人體內的狀態，更加真實地反應人皮膚受到各種刺激后的反應。

MMP-1可作為評估皮膚光損傷特別是真皮成纖維細胞光損傷的一個特異性指標。大量的實驗證明紫外線照射可引起成纖維細胞表達基質金屬蛋白酶(MMPs) 增多，特別是UVA的高穿透性使其作用部位位于真皮，成纖維細胞是其作用的主要靶細胞，UVA對成纖維細胞分泌MMPs有較大的影響[3-4]。許多證據表明在人的皮膚上，MMP-1隨年齡的增加而增加，并且與紫外線導致的慢性光損傷使膠原排列紊亂、斷裂等有密切關系，因此認為MMP-1介導的膠原破壞的累積是皮膚老化(光損傷的重要表現之一)的主要原因[5-6]。Naru等[7]對以真皮成纖維細胞作為體外光老化模型的研究中，觀察到UVA1照射正常成纖維細胞后MMP-1 mRNA的表達水平與照射強度呈正相關。UVA1 誘導皮膚產生的ROS，通過MAPK信號傳導通路也可促進MMP-1的表達，同時抑制膠原的合成[8]。Fagot D等[2]用3種體外培養的人工皮膚模型(僅含表皮的EPISKIN、含表皮和真皮的復合人工皮、體外培養的正常人皮膚)及體外培養的角質形成細胞和成纖維細胞進行對比實驗，發現經紫外線照射后，僅含表皮的EPISKIN和從正常人皮膚中分離出來的角質形成細胞的 MMP-1的分泌不增加，而含表皮和真皮的復合人工皮和體外培養的正常人皮膚MMP-1的分泌是增加的，并且呈現劑量依賴，說明MMP-1可特異性表征真皮光損傷。

應用ELISA法檢測培養液中細胞分泌細胞因子量的濃度和濃度變化趨勢是一種簡單可行的辦法，本實驗主要是檢測MMP-1濃度變化的趨勢。我們的結果顯示與未照射組相比，當UVA1的劑量在10J/cm2時，MMP-1的分泌稍有增加，但與0J/cm2組相比差異并無顯著性意義(P>0.05);自20J/cm2以后MMP-1分泌量逐漸增高，至70J/cm2和90J/cm2時MMP-1的分泌較前有所降低，我們主要是考慮大劑量的UVA1照射導致死亡的細胞增多，因此MMP-1的分泌下降，UVA1照射可誘導人工皮膚高分泌MMP-1的結果與上述許多研究的結果相符。在劑量方面細胞實驗多數使用2～10J/cm2的UVA就可導致成纖維細胞分泌MMP-1的值增高，Pascual-Le等[9]用單獨的真皮替代物照射紫外線UVA時，使用10J/cm2的照射劑量就可使成纖維細胞分泌MMP-1增高，我們得出的結果偏高，考慮我們使用的是包含了表皮和真皮三維培養的人工皮膚，紫外線穿透表皮時需要損耗一定的劑量，另外我們使用的是波長較長的UVA1，研究認為波長越大的紫外線效能越小，需要使皮膚損傷的劑量就越大[10]，從這個角度上說，我們的結果也符合理這個規律。從以上的實驗結果我們得出，與未照射組相比，UVA1照射劑量自20J/cm2后對人工皮膚MMP-1分泌就有顯著性的影響，說明在該劑量后人工皮膚就出現了光損傷;在照射劑量為50J/cm2以前MMP-1的分泌量呈現劑量依賴性，之后有所下降，說明50J/cm2以后光損傷較嚴重，這為我們下一步應用人工皮膚研究光損傷時選擇合適的照射劑量奠定基礎。

[參考文獻]

[1]Fisher GJ， Datta SC， Talwar HS，et al. Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism[J].Nature，1996，379(6563):335-339.

[2]Fagot D，Asselineau D，Bernerd F.Matrix metalloproteinase-1 production observed after solar-simulated radiation exposure is assumed by dermal fibroblasts but involves a paracrine activation through epidermal keratinocytes[J]. Photochem Photobiol，2004，79(6): 499-505.

[3]Hyeon HK，Chung MS，Chi HP，et al.Eicosapentaenoic acid inhibits UV induced MMP-1 expressing in human dermal fibroblast[J]. J Lipid Res，2005，46(8):1712-1720.

[4]Grant GM，Cobb JK，Castillo B，et al. Regulation of matrixmetal loproteinases following celluar transformation[J].J Cell Physiol，1996，167(1):177-183.

[5]Varani J，Warner RL，Gharaee-Kermani M，et al. Vitamin A antagonizes decreased cell growth and elevated collagen-degrading matrix metalloproteinases and stimulates collagen accumulation in naturally aged human skin[J]. J Invest Dermatol，2000，114(3):480-486.

[6]Wang F， Garza LA， Kang S，et al. In vivo stimulation of de novo collagen production caused by cross-linked hyaluronic acid dermal filler injections in photodamaged human skin[J]. Arch Dermatol，2007，143(2):155-163.

[7]Naru E，Suzuki T，Moriyama M，et al. Functional channgs induced by chronic UVA irradiation to cultured human dermal fibroblasts[J].Br J Dermatol，2005，153 supp 2:6-12.

[8]Wenk J，Brenneisen P，Meewes C，et al.UV induced oxidative stress and photoaging[J].Curr Probl Dermatol，2001，29:83-94.

[9]Pascual-Le Tallec I，Korwin-Zmijowska C，et al.Effects of simulated solar radiation on type I and type III collagens， collagenase (MMP-1) and stromelysin (MMP-3) gene expression in human dermal fibroblasts cultured in collagen gels[J]. J Photochem Photobiol B，1998，42(3):226-232.

[10]Eiichiro M，Akihisa T，Kou K.Time course and spacial distribution of UV effects on human skin in organ culture[J]. J Kadiat Res，2008，49(3):269-277.

[收稿日期]2009-11-18 [修回日期]2010-01-29

編輯/張惠娟