利用原生質體融合技術構建植酸酶\\纖維素酶枯草芽孢桿菌工程菌的研究

摘要:以產植酸酶枯草芽孢桿菌(A5)復合誘變的再生突變株Z56和產纖維素酶枯草芽孢桿菌(B6)復合誘變的再生突變株X57為親本，利用雙親滅活原生質體融合技術進行種內融合，構建可同時產植酸酶、纖維素酶的工程菌。結果表明，從構建的385個融合子中篩選到6株兩種酶活性相對較高的工程菌，其中R4、R5的纖維素酶產量高于親本，植酸酶產量也相對較高;粗酶液用90 ℃處理10 min后，纖維素酶剩余酶活分別為對照的62%和58%，植酸酶剩余酶活分別為對照的73%和71%。

關鍵詞:枯草芽孢桿菌;植酸酶;纖維素酶;原生質體融合;工程菌

中圖分類號:Q814文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.05.007

Study on the Application of Intraspecific Protoplast Fusion Technique to Construct Bacillus subtilis Engineering Bacteria with Phytase and Cellulase Activities

XIE Feng-xing， ZHANG Feng-feng， ZHOU Ke， ZHAO Yu-jie

(Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology，Tianjin 300192，China)

Abstract:In order to construct phytase and ellulose-producing engineering bacteria， intraspecific protoplast fusion between Bacillus subtilis Z56， phytase-producing strain obtained from protoplast combination mutagenesis， and Bacillus subtilis X57， ellulose-producing strain obtained from protoplast combination mutagenesis， was performed by inactivated protoplast fusion technique. The results showed that 6 fusants with high phytase and cellulose activities were selected from 385 regeneration colonies. The productions of ellulose of R4 and R5 were higher than the parental strain and phytase activities were relatively high. The enzyme thermal stability results showed that the remained ellulose activities of R4 and R5 kept 62% and 58%， while the remained phytase activities kept 73% and 71% when the crude enzymes were treated with 90℃ for 10 min.

Key words: Bacillus subtilis;phytase;ellulose;protoplast fusion;engineering bacteria

植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解產生磷酸和肌醇的一類酶的統稱[1]。植酸酶作為飼料添加劑，一方面可以有效的提高動物對飼料中磷的利用率，從而使飼料中添加的無機磷減少70%[2]，降低飼料成本的同時節約磷礦資源，另一方面可將動物糞便中排磷量減少30%～50%[3]，減輕環境污染，有利于生態農業的發展。纖維素酶是一類將纖維素水解成葡萄糖的一組酶的統稱。它可破解富含纖維的細胞壁，使其包含的蛋白質、淀粉等營養物質釋放出來并加以利用，同時又可將纖維降解為可被畜禽機體消化吸收的還原糖，從而提高飼料利用率[4]。雖然目前利用微生物發酵生產酶制劑已達到工業化水平，但外源酶制劑的熱穩定性問題一直沒有得到很好的解決，導致其在飼料加工的高溫(70～90 ℃)制粒工藝中，酶的活性大幅度喪失[5]。枯草芽孢桿菌是一種能產內生芽孢的革蘭氏陽性菌，有較強的熱穩定性，同時也是農業部允許作為飼料添加劑的安全菌種之一，可直接添加到飼料當中[6]。但天然的枯草芽孢桿菌的植酸酶和纖維素酶的表達量都很低，難以規模化生產，且一般很少有能同時分泌上述兩種酶的菌株。為此，選育植酸酶、纖維素酶活性高的菌種，以高酶活性的枯草芽孢桿菌制劑代替外源酶制劑，可能成為解決飼料添加劑中酶活性低的一條重要途徑。

本研究擬以環境中選育的枯草芽孢桿菌為材料，在原生質體復合誘變，篩選高酶活突變株的基礎上，對突變株的原生質體加以融合構建熱穩定性強、高酶活工程菌，為飼料添加劑提供優質的菌種資源，為動物獲得外源酶提供一條新的途徑。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株產植酸酶枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A5、產纖維素酶枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B6。

1.1.2培養基完全培養基:蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL。基本培養基:葡萄糖 5 g，(NH4)2SO4 2 g，檸檬酸鈉1 g，K2HPO4·3H2O 14 g，KH2PO4 6 g，MgSO4·7H2O 0. 2 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。再生基本培養基:其中固體培養基為將基本培養基中的蒸餾水換成原生質體穩定液，半固體培養基瓊脂減半。植酸酶鑒別培養基及發酵培養基參照文獻[2]。纖維素剛果紅鑒別培養基:羧甲基纖維素鈉5.0 g，(NH4)2SO4 2.0 g，剛果紅0.1 g，KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，蛋白胨5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL。纖維素酶發酵培養基:麩皮50.0 g，蛋白胨3.0 g，(NH4)2SO4 3.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH6.0。

1.2方法

1.2.1原生質體的復合誘變將A5、B6培養后制備原生質體，對原生質體進行梯度稀釋后取2 mL和2%DES 2 mL充分混合，振蕩處理0.5 h后加入2 mL 2%Na2S2O3終止反應，然后取5 mL混合液置于紫外燈下誘變處理2 min。取0.1 mL菌液于再生半固體培養基中，混勻倒入再生固體培養基中，每個梯度3個重復。培養2 d后，將誘變再生的突變株劃線培養，待單菌落長出，分別挑取單菌落點種在植酸酶、纖維素酶篩選培養基上，中間接對照，四周接4株突變株，37 ℃培養，2 d后觀察，挑選水解圈較大的突變株測量菌落大小(C)和水解圈大小(H)，通過比較H/C比值篩選產酶高的突變株。

1.2.2原生質體融合與再生將親本原生質體分別滅活后，各取1 mL混勻靜置5 min，離心后加促溶劑(10%PEG溶液)36 ℃水浴，促融10 min，離心收集菌體，將沉淀充分懸浮于2 mL 原生質體穩定液中。

取融合液用原生質體穩定液稀釋至10-4，取0.1 mL 菌液與滅菌并冷卻至50 ℃的再生半固體培養基中混勻，迅速傾入底層為再生固體培養基的平板上，36 ℃培養2 d，檢出融合子。

1.2.3融合子的篩選將融合子在基本培養基上劃線培養，挑選單菌株點種于纖維素酶和植酸酶鑒別培養基上培養，挑選同時產兩種酶的菌株并測量水解圈大小，對構建工程菌的產酶能力進行初步篩選。

將初篩的工程菌株分別接種到植酸酶、纖維素酶發酵培養基中，接種于植酸酶發酵培養基中的菌液于40 ℃，150 r/min振蕩培養48 h后取樣測定酶活，接種于纖維素酶發酵培養基中的菌液于30 ℃振蕩培養42 h后取樣測定酶活，對工程菌株進行復篩，以親本的酶活作為對照。

植酸酶酶活力單位定義為:在測定條件下，每分鐘從植酸鈉溶液中釋放1 μmol無機磷所需要的酶量，用U表示。

纖維素酶酶活力單位定義為:1 mL酶液每分鐘產生1 μg葡萄糖為一個酶活單位(U)。

1.2.4工程菌酶活熱穩定性檢測將產酶量相對較高的菌株的粗酶液分別在60，70，80，90 ℃下保溫10 min，再分別測定植酸酶和纖維素酶值，以正常條件下的測定值為對照。

2結果與分析

2.1A5原生質體復合誘變

選取復合誘變后菌株144株點種在植酸酶的鑒別培養基上，觀察水解圈大小，挑選出78株正突變株。將78株正突變株繼續點種在植酸酶的鑒別培養基上，37 ℃恒溫培養48 h做驗證試驗，測量菌落直徑(C)和水解圈直徑(H)，將其中H/C值大于對照的再生株進行比較，篩選優良突變株，結果見表1。

一般H/C值越大說明菌株的產酶能力越強，在同等條件下，以H/C值來初步篩選突變株的產酶能力操作簡單且比較直觀，是一種行之有效的方法[7]。由表1可知，Z21、Z52、Z56、Z72、Z77的H/C值在2.0以上，其中Z56號菌株的H/C值達2.58，說明其產酶能力相對較強，因此，挑選Z56號菌株作為原生質體融合的親本。

2.2B6原生質體復合誘變

選取復合誘變后再生的158個突變株點種在纖維素剛果紅鑒別培養基上，根據水解圈大小挑選出58個正突變株。將58株突變株接種在纖維素剛果紅鑒別培養基上做驗證試驗，2 d后測量菌落直徑(C)和水解圈直徑(H)，比較H/C值的大小，將其中H/C值大于對照的再生株進行比較篩選優良突變株，結果見表2。

由表2可知，復合誘變得到的再生突變株中H/C值大于1.30的有6株，其中X57號菌株的H/C值最大，為1.55，說明其產纖維素酶的能力相對較高，因此，挑選該菌株作為原生質體融合的親本。

2.3融合子的篩選

一共構建了3批工程菌，分別從第一、二、三批構建的工程菌中挑選85、90、210個融合子點種于纖維素酶和植酸酶鑒別培養基上用于酶活的初篩。結果發現，再生的385個融合子中的54株在植酸酶和纖維素酶鑒別培養基上能同時產生明顯水解圈，又將此54株菌劃線培養后的單菌落點種到植酸酶和纖維素酶的鑒別培養基上進一步篩選，發現其中的6株產酶比較穩定(分別命名為R1～R6)，且所產生的水解圈相對較大，結果見表3。

由表3的H/C值分析發現，構建的6株工程菌產植酸酶能力強弱依次為:R4>R1>R6>R5>R2>R3，產纖維素能力的強弱依次為R4>R2>R6>R5>R1>R3。對纖維素酶和植酸酶的H/C值綜合分析發現，R4工程菌的產酶能力相對較強，而R3的產酶能力最弱。H/C值只能在一定程度上反應菌株的酶活，要具體比較菌株產酶能力需采取定量測定的方法。對此6株菌進行發酵培養測定的酶活值見表4。

從表4可知，構建的6株工程菌產植酸酶的能力都顯著低于對照，其中R4、R5和R6產植酸酶的能力相對較高，分別為276.5、271.8和271.3 U/mL;而R2、R4、R5的纖維素酶酶活值高于對照，分別為214.2、223.5和224.8 U/mL，但與對照差異不顯著。綜合比較發現，R4和R5菌株植酸酶和纖維素酶的產量都相對較高，因此，選此2株菌用于工程菌酶活熱穩定性檢測。

2.4工程菌酶活熱穩定性檢測

從圖1、2可知，構建工程菌的植酸酶和纖維素酶酶活值隨處理溫度的升高而逐漸降低。60 ℃處理10 min后，R4號菌株的植酸酶產量顯著

低于對照，但纖維素酶產量與對照差異不顯著，R5號菌株的測定結果正好與R4菌株相反。70 ℃ 處理10 min后，R4和R5的植酸酶和纖維素酶都顯著低于對照，植酸酶分別為對照的76%和83%，纖維素酶分別為對照的68%和63%。隨后，工程菌的酶活對熱的敏感性降低，即用80 ℃和90 ℃處理的酶活值與70 ℃處理的差異不顯著。90 ℃處理10 min后，R4和R5的植酸酶分別為對照的73%和71%，纖維素酶分別為對照的62%和58%。

3 討論與結論

原生質體融合技術被廣泛用于微生物種內、種間和屬間的性狀改良，用以構建目的工程菌。李思光等[8]采用原生質體融合技術進行了產棕櫚油酸酵母Saccharomyces cerevisiae No.12.926和產脂酵母Rhodotorula No.12.908的融合研究，獲得了棕櫚油酸高產酵母工程菌株。顏念龍等[9]將蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的原生質體進行融合，構建了1株對黃瓜枯萎病菌具有拮抗作用，對小菜蛾的校正殺蟲效率在59%以上，并具有內生定殖能力的工程菌。余荔華等[10]將小麥根際聯合固氮菌(Klebsiella oxytoca)與枯芽孢桿菌(Bacillus subtilis)進行原生質體融合，成功構建了具有耐熱、抑菌、固氮等優良性狀的工程菌。上述的研究結果說明原生質體的融合，可使雙親的遺傳物質在融合子中整合，通過定向篩選，可得到帶有目的性狀的工程菌，且新性狀可穩定遺傳。而將雙親的原生質體滅活后再融合可以不用對親本進行遺傳標記，從而提高篩選效率[11]。

本研究分別對產植酸酶枯草芽孢桿菌A5、產纖維素酶枯草芽孢桿菌B6菌株進行了原生質體的復合誘變，通過初篩、復篩從A5的144個再生突變株中篩選到產酶能力相對較強的Z56，從B6的158個再生的突變株中篩選到產酶能力相對較強的X57。以Z56和X57為親本，利用親本滅活原生質體融合技術構建植酸酶、纖維素酶的基因工程菌。從三批構建的385個融合子中篩選到6株產兩種酶的能力相對較強的工程菌。通過定量測定其酶活發現，其中R4和R5纖維素酶產量高于親本，植酸酶的產量也相對較高，且工程菌的熱穩定性較強，90 ℃處理10 min后，R4和R5植酸酶剩余酶活為對照的73%和71%，纖維素酶剩余酶活為對照的62%和58%。

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