溫度對鯉魚口服免疫后免疫應答的影響

摘要:為研究溫度對鯉魚(Cyprinus carpio)口服免疫后免疫應答規律的影響，試驗設定了兩個溫度梯度，并測定了各溫度梯度下鯉魚口服免疫遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)藥餌后，魚體內血清抗體效價、血清γ球蛋白含量和血清γ球蛋白百分比、血液嗜中性粒細胞吞噬活性、溶菌酶活性和超氧化物歧化酶的活性的變化。結果表明:25 ℃低溫組抗體效價自第28 天顯著高于30 ℃高溫組，低溫組γ球蛋白含量第14 天高于高溫組，在56 d有極顯著差異。溫度能顯著影響鯉魚嗜中性粒細胞的吞噬、溶菌酶和SOD活性，低溫組除嗜中性粒細胞的吞噬活性顯著低于高溫組外，溶菌酶和SOD的活性均顯著高于高溫組。

關鍵詞:溫度;鯉魚;免疫指標;口服免疫

中圖分類號:S965.116文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.05.014

Effect of Temperature on Immunization Response of Common Carp with Oral Immunization

LIU Yu-lan， XING Ke-zhi， DONG Shao-jie， YANG Guang

(Department of Fishery Science ，Tianjin Agricultural College，Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture of Tianjin， Tianjin 300384， China)

Abstract:Antibody titer， γ globulin percent， γ globulin content， phagocytic activity of neutrophil and activities of LSZ and SOD in the serum of common carp under two kinds of temperature were determined to study effective of temperature on immunization response of common carp with oral immunization. The results showed that the antibody titer of low temperature group was obviously higher than high temperature group from 28 day. γ globulin content of low temperature group was higher than high temperature group and up to obvious level at 56 day. The temperature could affect significantly phagocytic activity of neutrophil and activities of LSZ and SOD. Phagocytic activity of low temperature group was lower than that of high temperature， however， activities of LSZ and SOD at the lower temperature were higher obviously than that at higher temperature.

Key words: temperature; common carp; immunization response; oral immunization

在魚類的疾病防治中，免疫學方法是被普遍推崇的手段之一，但多數疾病的免疫防治效果尚不令人滿意[1]。影響魚類免疫應答的因素較多:抗原接種方法是重要的影響因子之一，注射免疫效果明顯，但有眾多弊端，口服免疫方便、安全的優勢被人們認可[2]，但抗原在動物消化系統的降解及免疫系統的呈遞會一定程度上影響免疫應答反應;此外，環境溫度也是極為重要的影響因子，在臨界溫度之上，體液免疫隨溫度的增加而增加，低于臨界溫度，體液免疫受抑制或者反應很低。Newma[3]的研究發現，虹鱒的免疫球蛋白M(IgM)屬于溫度依賴型，在一定程度上佐證了魚類體液免疫受溫度影響的特點。非特異性免疫指標可能與特異性免疫相反，在低溫環境下，非特異性防御發揮重要的作用，從而彌補特異性免疫應答的不足[4]。

為了探討鯉魚口服免疫應答反應的規律，本試驗研究了兩種溫度條件下，定期投喂添加滅活細菌的飼料后，鯉魚部分非特異性免疫應答反應指標的變化。

1材料和方法

1.1試驗用菌及疫苗制備

試驗用遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus Fleming)購于農業部漁業動植物病原庫。細菌經24 h培養后，用滅菌生理鹽水(0.85%)洗下，并調整密度至1×1010 cfu/mL，以終濃度為0.3%的福爾馬林滅活細菌(28 ℃、48 h)。將滅活遲緩愛德華氏菌液按1∶1比例與1%羧甲基纖維素混合后噴涂于浮性飼料表面，制成藥餌。

1.2試驗魚及飼養條件

試驗鯉魚均質量(30±11)g，為天津市鯉魚良種試驗場自繁自養。將隨機挑選的健康試驗魚160尾，隨機分為4組，分別養殖于直徑1.2 m，水深 0.5 m的圓形水泥桶中。加熱棒控制水體溫度，使試驗組Ⅰ、Ⅱ為(25.5±1)℃，Ⅲ、Ⅳ組為(30±0.5)℃。

試驗期間早晚投飼，并在試驗的第3周開始投喂藥餌(30 g/組，折合菌投喂量為1×109 cfu/(尾·d)，持續1周，投飼1 h后及時清除殘餌。每隔4～5 d置換充分曝氣的等溫水體(總體積1/3)，使水體溶氧維持在3.5 mg/L以上。

1.3血樣采集與處理

藥餌開始投喂前、后間隔兩周，從各試驗桶中隨機撈取鯉魚6尾，尾動脈采血1.5 mL，其中0.3 mL制備抗凝血，其余部分提取血清備用。

1.4非特異免疫指標測定

1.4.1嗜中性粒細胞吞噬活性0.3 mL抗凝血中加入120 μL甲醛滅活溶壁微球菌(A600=0.500)，混勻后28 ℃孵育30 min，間隔15 min時混勻1次。孵育后離心(500×g，5 min)，取白細胞層涂片，瑞氏染色后顯微計數嗜中性粒細胞及吞噬細菌量。吞噬活性用吞噬百分比(Phagocytic percentage，PP)和吞噬指數(Phagocytic index， PI)表示:

1.4.2溶菌酶活性溶菌酶活性測定參照朱壯春等[5]的方法，并稍作調整:用0.067 mol/L，pH=6.64磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)將滅活融璧微球菌配制成一定濃度(A500=0.320±0.005) ，取3 mL菌懸液與50 μL待測血清混合，37.0 ℃反應30 min，測定反應前后混合溶液的吸光值(分別為A0和A)。溶菌酶活力(U)按下式計算:U=A0-A0 。

1.4.3超氧化物歧化酶(SOD)測定鄰苯三酚自氧化速率以及標準酶和樣本SOD酶活力單位過程參考董海勝[6]的方法:2.5 mL 50 mmol/L Tris-HAc(pH=8.20，含1 mmol/L EDTA-2Na)和一定體積三蒸水混合，25.0 ℃預熱10 min，加入V1 mL 4.5 mmol/L 鄰苯三酚，混勻后立即測定325 nm處初始值和1 min后的吸光值，二者之差即為鄰苯三酚自氧化速率ΔA325/min，測定標準酶和樣本SOD酶活力單位時同時加入一定體積鄰苯三酚(V1)和樣液或標準液(V2)，立即測ΔA325/min。反應總體積為4.5 mL，V1和V2根據鄰苯三酚自氧化速率和樣液抑制率調整，總體積由三蒸水調節。為簡化試驗操作過程，參考鄒國林等[7]方法將超氧化物歧化酶酶活力單位與抑制率線性化，大大節約試驗時間。

1.5試驗數據處理

試驗數據用SPSS 13.0統計軟件，顯著性檢驗采用獨立樣本學生-T檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果與分析

2.1養殖溫度對嗜中性粒細胞吞噬活性的影響

鯉魚口服免疫前后嗜中性粒細胞吞噬活性變化見表1。經過為期56 d的養殖試驗，兩個溫度組吞噬指數在免疫后都有增加，14 d時達到最高水平，之后急劇下降，甚至比免疫前還低，到56 d又回到免疫前水平;吞噬百分數受口服免疫的影響不大。溫度影響鯉魚口服免疫后細胞吞噬活性，免疫后42 d低溫組吞噬指數顯著低于高溫組(P <0.05)，吞噬百分數有極顯著差異(P <0.01)。

2.2養殖溫度對溶菌酶活性的影響

不同溫度條件下，鯉魚口服免疫前后溶菌酶活性變化趨勢見表2。在為期56 d的養殖試驗中，低溫組在第28天檢測到溶菌酶最高值(0.054 1 U)，高溫組則在第14天出現最高值(0.050 4 U)，低溫組在投喂后28 d和56 d極顯著高于高溫組(P<0.01)。

2.3養殖溫度對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

酶活力單位常用對數與抑制率直線方程為y = 0.646 1x - 0.583 7(R2 = 0.996 6)，抑制率在17%～77%范圍有很好線性關系。根據以上標準曲線公式，計算出的不同養殖溫度下，鯉魚口服免疫前后SOD活性變化趨勢見表3。兩組SOD活性在免疫后都有降低，42 d后又逐漸增加。低溫組分別于14 d和28 d分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)高于高溫組。

3討論

遲緩愛德華氏菌是魚類(鰻、鲇、鲆等)、兩棲類(蛙)、爬行類(鱉、鱷魚)的重要致病菌之一，給水產養殖業帶來巨大經濟損失[8]。水產養殖業中，采用免疫接種方式提高養殖動物體液免疫應答水平和對相應致病菌保護率的研究很多，該方法不僅可以顯著提高動物抗體效價，對血清SOD活性、溶菌酶活性，白細胞吞噬活性和攻毒存活率也有顯著激活作用[9-12]。Salati[13]研究發現，愛德華氏菌滅活菌體、細胞碎片和細胞提取物、LPS等作為抗原均顯示出良好的免疫效果，本研究結果顯示，口服免疫對鯉魚嗜中性粒細胞吞噬指數、溶菌酶活性有一定激活作用。滅活愛德華氏菌口服免疫鯉魚后，分別在14 d和28 d出現最大值，表明口服免疫對其非特異性免疫指標具有一定的刺激作用。愛德華氏菌對非特異性免疫的激活作用可能是其細胞壁的內毒素發揮作用。眾所周知，細菌內毒素對機體既有毒性，也有免疫激活作用，內毒素首先作用于機體的單核巨噬細胞，誘導細胞分泌多種介質分子，低含量的介質對機體有益，可起到免疫激活作用;高含量的介質對機體有害，可導致機體高熱、低血壓、彌漫性血凝，甚至休克、死亡等嚴重后果。

溫度作為魚類最重要的環境因素之一，幾乎可影響機體所有生命活動。機體的生命活動離不開各種酶促反應，這些反應都有最適溫度。在最適溫度下，酶活性最高;低于或高于最適溫度，酶活性受不同程度抑制。本試驗結果顯示，溫度對鯉魚口服免疫后嗜中性粒細胞吞噬、溶菌酶和SOD活性有顯著影響，除吞噬活性表現出低溫組低于高溫組，溶菌酶和SOD都表現出低溫組活性高于高溫組。河蜆溶菌酶活性和SOD在13～30 ℃養殖溫度下逐漸上升，25℃時比30℃時高[14]，而本研究的這兩種酶在25℃養殖溫度下比30℃的高，這些差異表明，不同生物體具有不同性質的溶菌酶和SOD，這是物種長期進化中產生的，對機體非特異性免疫意義重大[15]。

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