面粉中毒麥成分檢測方法研究進展

摘要:從分子技術和化學技術兩方面綜述了近年來面粉中毒麥成分的一些相關檢測方法，包括毒麥及其近似種的分型研究等，同時也闡述了相關檢測方法的應用與理論依據。

關鍵詞:面粉;毒麥成分;檢測

中圖分類號:S211.7文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.03.044

Research Advances on the Detection of Lolium Content in Flour

LIU Wang1，KANG Lin2， GAO Bi-da1，CHEN Dong-mei 2

(1.Bio-safe Science and Technology Collage，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China;2.Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen 518010，China)

Abstract:Some related detection methods on the Lolium temulentum in flour were summarized during recent years from the aspects of molecule technology and chemistry technology， such as genotype analysis of Lolium and its similar species. Meanwhile， the applications of related detection methods and the basis theory werealso elaborated.

Key words: flour;Lolium temulentum;detection

面粉作為人類的主要食物來源有著舉足輕重的地位。據最新統計:2008年1—10月累計進口小麥373萬t。資料顯示，中國進口小麥主要來自美國、澳大利亞、德國、法國、阿根廷及東北亞、中亞和獨聯體等國家，這些國家均是毒麥的主要分布區。

中國在進口糧谷類產品中經常截獲毒麥:如1989年南京、青島、廣州等14個出入境檢驗檢疫局分別從美國、法國等11國的進口糧谷類產品中截獲21批次毒麥;2004年深圳局從旅客攜帶物中截獲3批次毒麥。

毒麥種子含有毒麥堿(Temuline-C7H12N2O)，能麻痹動物中樞神經，人吃了含4%毒麥成分的面粉就會引起中毒反應，家禽食入劑量為體重0.7%的毒麥時就會中毒。據不完全統計，1983年中國因食用毒麥或含毒麥成分的面粉制品而中毒的人數多達1 200多人。據有關部門統計，2000年中國為清除毒麥所花經費至少達2億元人民幣[1-5]。

對于面粉中毒麥成分含量的檢測未見有相關報道。但目前，各種檢測技術已非常成熟，而且已廣泛應用于各個領域，可以借鑒其方法對面粉中的毒麥成分進行檢測。

1分子技術在毒麥檢測及相關方面的應用研究

1.1SNP技術

單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指在染色體基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA 序列多態性，而其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。它包括單堿基的轉換、顛換、插入及缺失等形式[6]。

SNP技術作為一類遺傳標記在遺傳學分析中得以廣泛應用。SNP 具有很高的遺傳穩定性，并且此標記在人群中只有兩種等位型，無需對片段長度做出測量，所以SNP檢測分析方法易實現自動化[7]。SNP作為“第二代DNA遺傳標記”可應用于構建高密度遺傳連鎖圖譜，進行致病基因以及人類起源遷移進化的研究，也可以應用于家畜遺傳育種以及遺傳圖譜和物理圖譜的整合。針對面粉中毒麥成分的檢測，SNP技術為特異性檢測毒麥成分提供了技術支持。

對于等位基因的鑒別(AD)分析中的每一個樣本，使用唯一的一對熒光探針，例如，兩個TaqMan-MGB探針來標記一個SNP位點。一個熒光探針與野生型(等位基因1)完全匹配，另一個熒光探針與突變完全匹配(等位基因2)。

等位基因鑒別分析將未知樣品分為以下幾類:純合子 (樣本只含有等位基因1或等位基因2);雜合子 (樣本同時含有等位基因1或等位基因2)。

張姮等[8]首次在植物檢疫上應用SNP技術對毒麥屬6個種進行分型研究，SNP技術的強大的檢測能力和檢測量可以代替基因芯片技術，而它的成本比基因芯片要廉價的多。除此之外，同樣是熒光標記，顯示的圖形是不同的，以曲線顯示的檢測圖形如果在同一循環數開始出現“拐點”會出現重疊現象，而利用SDS 2.0(Applied Biosystems)軟件程序進行終點分析，通過檢測不同等位基因所標的FAM和VIC熒光強度不同所出現的點位(靠近Y軸或X軸)不同，圖形清晰明了;由于使用的熒光標記不同，出現的圖形背景也不同，由于SNP技術只以點為基線，不需要調整，背景也很清晰。

1.2PCR-RFLP技術

RFLP(限制片段長度多態性)是根據不同品種(個體)基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生變化。

張姮等[9]利用此技術首次從分子水平上鑒定區分了毒麥屬4個種。對毒麥屬近似種的rDNA ITS序列的限制性內切酶酶切圖譜分析，根據酶切圖譜的差異選擇合適的限制性內切酶BssSI、TfiI、NehI，人工分析RFLP帶型圖譜。

現在可應用于物種鑒定的分子生物學技術手段有很多，但有些技術由于操作復雜、成本高或其他一些因素，限制了應用范圍。而PCR-RFLP技術由于其簡單易行、周期短、費用低的特點成為實際應用中常選用的物種鑒定分子生物學手段[10]。

1.3芯片技術

生物芯片技術是20世紀90年代中期快速發展起來的分子生物學高新技術，是各學科交叉綜合的新學科[11]。

基因芯片基本原理是將核酸片段作為識別分子，按預先設置的排列固定于特定的固相支持載體的表面形成微點陣，利用反向固相雜交技術，將標記的樣品分子與微點陣上的核酸探針雜交，以實現多到數萬個分子之間的雜交反應，通過特殊的檢測系統來高通量、大規模地分析檢測樣品中多個基因的表達狀況或者特定基因分子的存在[12]。

2008年，李文芬等[13]利用基因芯片技術檢測地中海實蠅、納塔爾小條實蠅和芒果小條實蠅。對于水果類害蟲如實蠅，一般的實驗室檢測實蠅種類主要依靠培養和直接鏡檢等形態學鑒定，其操作繁瑣、費時，并且需要高度的專業知識。地中海實蠅芯片技術為中國進口果蔬中檢疫性實蠅快速篩查和種類鑒定提供了檢測方法，為有害生物的快速檢測提供了新方法。

基因芯片由于具有高通量、高度并行性、高靈敏度等優點而在各個領域得到了廣泛的應用[14]，包括有基因表達譜芯片，轉基因農產品檢測芯片，新生兒基因檢測芯片，肝炎病毒、艾滋病毒基因檢測芯片等，其中腫瘤檢測、肝病檢測、自身免疫疾病診斷芯片即將或已經進入臨床應用和商業化運作[15]。物種鑒定檢測芯片研制也在起步當中，如應用于臨床致病真菌鑒定[16]和水產食品中常見病原微生物鑒定[17]等，因此，在面粉中毒麥成分檢測方面也有其應用價值。

2化學檢測技術應用

化學檢測技術在國內外普遍應用于檢測毒素和化學成分，早在1993年國外就有對毒麥堿進行檢測的記錄。

2.1氣相色譜分析法

1993年，Mark R. TePaske等[18]通過氣相色譜分析法從被內生菌感染的羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)、大麥屬(Hordeum)、針茅屬(Stipa)和早熟禾屬(Poa)的樣品中檢測出不同濃度的毒麥堿。

氣相色譜法所分析的物質需要在操作溫度下能氣化而不分解。毒麥堿的沸點在760 mmHg 下為224.2 ℃，蒸氣壓25 ℃條件下為0.092 6 mmHg，適應于氣相色譜。

Mark R. TePaske等人采用含有火焰離子探測器的Hewlett-Packard 5980A的氣相色譜儀進行分析。探測器完整地用光譜物理學SP4290積分儀所反應。在樣品的處理方面，過濾種子的抽提劑由CH2Cl2/MeOH/NH4OH組成，以75∶25∶0.5的比列配制。苯基嗎啉作為一種內在標準通常直接用于氣相色譜分析。把苯替嗎啉標準液(50 μg/mL)和抽提劑加入被磨成粉末狀的原料(10 mL/g)中，并一起放入螺帽玻璃蓋的離心分離管中。用線紋的錫箔紙緊緊的密封，在室溫下放入定軌搖床中一整晚(16 h)。混合物離心(2 500 rpm，25 min)后，取1 mL移入螺帽小瓶。然后把樣品密封在-15 ℃下保存，以用于氣相色譜法。

2.2高效液相色譜法

高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達4.9×107 Pa)，使流動相在高壓下快速流動，以提高分離效果;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜(每米塔板數可達幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。

高效液相色譜法由于其分析速度快、分離效能高、自動化等優點，廣泛應用于各類產品的化學成分檢測及鑒定，如奶粉中三聚氰胺的檢測[19]。用此方法時，高效液相色譜儀額外需要配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器，試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測定，外標法定量。制作標準曲線時用流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到濃度為0.8，2，20，40，80 μg/mL 的標準工作液，濃度由低到高進樣檢測，以峰面積—濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。

2.3液質聯用法

液質聯用法具有特異性好、靈敏度高的特點，在對化學成分進行檢測時，不僅能對其進行定量測定，還能進行定性確證，可用于面粉中毒麥堿成分的確證分析。

2006年，岳振鋒等[20]研究建立了牛奶樣品中10種四環素類多殘留的高效液相色譜串聯質譜確證方法，為牛奶樣品中四環素類藥物及其代謝產物殘留的監督檢驗和殘留監控提供技術了支持。2008年，中國也建立了奶粉中三聚氰胺成分檢測的國家標準[19]，試樣用三氯乙酸溶液提取，經陽離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質譜/質譜法測定和確證，外標法定量。待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線線性范圍內，超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。用此方法時，液相色譜-質譜/質譜儀應配有電噴霧離子源(ESI)。制作標準曲線時，取空白樣品按照應檢樣品同樣的處理方法處理，用所得的樣品溶液將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到濃度為0.01，0.05，0.1，0.2，0.5 μg/mL 的標準工作液，濃度由低到高進樣檢測，以定量子離子峰面積—濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。

3結論

隨著全球農產品貿易的日益頻繁，可能存在于面粉中的毒麥成分越來越引起人們重視。面粉是人類最主要的食物之一，面粉安全尤為重要，只要有一批面粉中攜帶有毒麥成分，就會造成重大事故，因此，對面粉中毒麥成分的檢測意義重大。

綜合目前的檢測手段，雖然檢測方法豐富，但都有其優勢與不足，對于檢測方法中準確率高的檢測方法，目前尚未建立。筆者通過對相關的一些檢測方法的分析，旨在總結出可行性高、低成本、高效益、經濟方便的毒麥成分檢測方法，建立快速檢測面粉中毒麥成分的體系。

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