溫度\\pH和金屬離子對不同果實轉化酶活性的影響

摘要:為國果實轉化酶的分離純化提供參考依據，研究了溫度、pH和金屬離子對蘋果、梨和桃中可溶性酸性轉化酶、可溶性中性轉化酶和細胞壁結合轉化酶。活性的影響結果表明，酸性轉化酶的最適反應溫度為40 ℃，而中性轉化酶為50 ℃;酸性轉化酶的最適pH在5左右，中性轉化酶的最適pH在7左右。金屬離子Mn2+和Ca2+顯著提高3種轉化酶的活性，而Cu2+，Mg2+和Zn2+也在一定程度上提高可溶性酸性轉化酶和細胞壁轉化酶的活性;Hg2+顯著抑制3種轉化酶活性，而Cu2+，Mg2+和Zn2+抑制可溶性中性轉化酶的活性，表明轉化酶的活性部位含巰基基團。對轉化酶特性與蘋果、梨和桃果實發育和品質形成的關系進行了討論。

關鍵詞:果實;溫度;pH;金屬離子;轉化酶

中圖分類號:Q946.5文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.03.006

Effects of Temperature， pH and Metal Ions on Invertase Activities in Different Fruits

GAO Xu， WANG Yong-zhang， LI Pei-huan， LIU Cheng-lian， YUAN Yong-bing

(College of Gardens and Horticulture， Qingdao Agriculture University， Qingdao， Shandong 266109， China)

Abstract:Effects of temperature， pH and metal on soluble acid invertase， soluble neutral invertase and cell wall-bounded invertase were studied in apple， pear and peach fruit. The results showed that the optimum temperature for acid invertase activity was 40 ℃， but that for neutral invertase activity was 50 ℃. The best pH for acid invertase activity was about 5， and that for neutral invertase activity was 7 or so. The results also showed that the activities of invertase were significantly enhanced by Mn2+ and Ca2+; Moreover， Cu2+， Mg2+ and Zn2+ also increased the activities of acid invertases. The activity of soluble neutral invertase was partially inhibited by Cu2+， Mg2+ and Zn2+， while the activities of all three isoforms of invertase were significantly inhibited by Hg2+. The function of invrtases in sugar metabolism was discussed in relation with fruit development and quality formation.

Key words: fruit; temperature; pH; metal ion; invertase

果實品質在很大程度上取決于果實內所含糖的種類、含量及其相對比例[1]。現有研究結果表明，葡萄糖、果糖和蔗糖是果實積累的主要可溶性糖[1， 2]，此外還有山梨醇等。糖的相互轉化及其代謝對果實發育、品質形成和風味具有顯著影響[1， 2]。蔗糖作為高等植物光合作用的主要同化產物，是碳水化合物運輸的主要形式，也是“庫”代謝的主要基質[3]，轉化酶、蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶是參與果實中蔗糖降解代謝的關鍵酶[1， 4-6]。其中，轉化酶將蔗糖不可逆的降解成果糖和葡萄糖，而蔗糖合酶所催化的反應是可逆的，所以轉化酶在蔗糖降解代謝中起著更重要的作用[2， 6]。目前，對果實糖代謝的研究多集中在與果實品質形成的相關指標、激素和酶活性的變化等，而對轉化酶的生理特性少有研究[2， 4]。本研究以蘋果、梨和桃為試材，對不同果實轉化酶的種類和特性進行了初步分析，以期為果實轉化酶的分離純化提供參考依據。

1材料和方法

1.1材料

試驗于2008—2009年在青島農業大學進行，試材為蘋果、梨和桃果實，在盛花后30~40 d取樣，果肉用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于轉化酶活性的測定。

1.2酶的制備和活性測定

酶液的制備參照Miron和Schaffer[7]的方法:稱取2 g果肉置于研缽內，加入少量石英砂和10 mL HEPES緩沖液。HEPES緩沖液組成為:50 mmol/L HEPES-NaOH(pH 7.5)，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA， 2.5 mmol/L DTT，10 mmol/L 抗壞血酸和5%PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)，冰浴研磨勻漿，12 000×g(4℃)離心20 min，上清液用稀釋10倍的提取緩沖液(不含PVPP)透析12 h(去除可溶性糖)用于可溶性轉化酶活性的測定。

細胞壁結合轉化酶的提取:提取可溶性蛋白后，加入5 mL HEPES緩沖液重復上述提取過程，離心后棄上清液，加入10 mL HEPES緩沖液(含500 mmol/L NaCl)，充分混勻后，低溫(4 ℃)振蕩浸提24 h，12000×g(4 ℃)離心20 min，用上述方法透析后用于細胞壁結合轉化酶活性的測定。上述所有操作均在0~4 ℃進行。

轉化酶活性的測定參照Miron和Schaffer[7]的方法進行。測定酸性轉化酶的反應液組成為:0.1 mol/L HAC-NaAC(pH 4.8)，0.1 mol/L蔗糖;中性轉化酶的反應液組成為:0.1 mol/L K2HPO4-HAC(pH 7.2)，0.1mol/L蔗糖;37 ℃反應30 min，用3，5-二硝基水楊酸測定形成的還原糖，以還原糖的生成量表示轉化酶活性。

1.3研究內容

1.3.1溫度對轉化酶活性的影響設10，20，30，40，50，60，70 ℃共7個不同水平，測定溫度對可溶性酸性轉化酶、可溶性中性轉化酶和細胞壁結合轉化酶活性的影響。

1.3.2 pH對轉化酶活性的影響以0.1 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液為反應介質，設pH為3，4，5，6，7，8共6個不同水平，測定pH對可溶性轉化酶和細胞壁結合轉化酶活性的影響。

1.3.3金屬離子對轉化酶活性的影響在各反應體系中加入不同種類的金屬離子，使陽離子的最終濃度達到1.0 mmol/L，分析金屬離子對上述3種轉化酶活性的影響。所有的測定均重復3~5次。

2結果與分析

2.1溫度對不同果實轉化酶活性的影響

從圖1、圖2和圖3可以看出，溫度對蘋果、梨和桃的果實轉化酶活性均有影響，且變化規律較為一致。隨著反應溫度的升高，可溶性轉化酶和細胞壁結合轉化酶的活性均逐漸增加，當轉化酶

活性達到各自的最高值之后，其活性又隨溫度的升高而逐漸降低。可溶性酸性轉化酶和細胞壁酸性轉化酶活性均在反應介質40℃時達到最高，分別為27.15 μmol/(g·h)(蘋果)、19.06 μmol/(g·h)(梨)、16.01 μmol/(g·h) (桃)和10.01 μmol/(g·h)(蘋果)、6.15 μmol/(g·h)(梨)、8.43 μmol/(g·h)(桃);而可溶性中性轉化酶在反應介質50℃時活性最高，為14.94 μmol/(g·h) (蘋果)、13.83 μmol/(g·h) (梨)和11.85 μmol/(g·h)(桃)。酸性轉化酶在大于4 0℃時，活性已下降。此后，隨著溫度的升高，3種轉化酶活性均逐漸降低，當反應溫度超過70 ℃以后，均失去活性。

2.2pH對不同果實轉化酶活性的影響

圖4和圖5表明，介質pH影響蘋果、梨和桃果實轉化酶活性。可溶性酸性轉化酶在介質pH 5時活性較高，為24.60 μmol/(g·h)(蘋果)、18.69 μmol/(g·h)(梨)和17.19 μmol/(g·h)(桃);可溶性中性轉化酶在介質pH 7時活性較高，達到15.54 μmol/(g·h)(蘋果)、12.52 μmol/(g·h)(梨)和8.9 3μmol/(g·h)(桃)，二者活性都遠高于pH在其它值時的活性。梨的細胞壁轉化酶在介質pH為4時其活性最高，達到7.26 μmol/(g·h);而蘋果和桃的細胞壁轉化酶在介質pH為5時其活性最高，分別為9.64 μmol/(g·h)和6.01 μmol/(g·h)。此后，隨著介質pH的升高，蘋果、梨和桃的細胞壁轉化酶的活性均逐漸降低，這說明三者果實細胞壁結合的轉化酶都以酸性轉化酶為主。

2.3金屬離子對不同果實轉化酶活性的影響

從圖6、圖7和圖8可以看出，不同金屬離子對蘋果、梨和桃的轉化酶活性的影響不同，但同一金屬離子對轉化酶活性的影響較為一致。Mn2+和Ca2+顯著提高可溶性酸性轉化酶、中性轉化酶和細胞壁轉化酶的活性，為對照活性的137%~310%;Cu2+、Mg2+和Zn2+也在一定程度上提高了可溶性酸性轉化酶和細胞壁轉化酶的活性，為對照活性的106%~188%。而Hg2+抑制了果實的可溶性酸性轉化酶、可溶性中性轉化酶和細胞壁酸性轉化酶活性，為對照活性的3.8%~9.7%;Cu2+，Mg2+和Zn2+抑制了可溶性中性轉化酶的活性，其中Cu2+對可溶性中性轉化酶的抑制最為明顯，為對照活性的46%~51%。

3討論

已有眾多的研究結果表明，高等植物的轉化酶依據其溶解性、亞細胞定位和最適pH不同，分為三種類型:可溶性酸性轉化酶、可溶性中性轉化酶和細胞壁酸性轉化酶[6]。不同形式的轉化酶在植物不同發育階段和不同組織中的作用不同。植物的光合同化產物蔗糖從韌皮部進入質外體后被分解為葡萄糖和果糖，以保證由韌皮部到質外體的蔗糖達到一定的濃度梯度，所以細胞壁結合轉化酶主要在韌皮部卸載和源/庫調控中起主要作用，而可溶性的轉化酶則主要存在于液泡中，在調控己糖和儲存于液泡中的蔗糖水平中發揮作用[8-10]。本研究證實，在蘋果、梨和桃果實中，3種形式的轉化酶均存在，并且在理化特性方面存在差異，可以認為:在果實發育的不同階段，轉化酶可以使不同亞細胞區域或不同來源的蔗糖得到有序的降解，定位于細胞壁中的細胞壁酸性轉化酶催化卸載到果實質外空間的蔗糖降解[11， 12];定位于胞質中的中性轉化酶催化通過共質體途徑直接卸入果肉細胞的蔗糖降解[11， 12]，還可降解在果肉細胞內由蔗糖合酶或蔗糖磷酸合酶催化合成的蔗糖[13];定位于液泡中的酸性轉化酶催化輸入果肉細胞液泡中的蔗糖降解。在果實發育的不同時期，蔗糖的來源及代謝存在一定的差異[14]，所以，轉化酶種類和活性的變化，在很大程度上可能與這種發育的階段性差異有關，轉化酶基因特異性表達[10]，以滿足果實生長發育的需求。

本研究結果表明，蘋果、梨和桃果實的轉化酶活性無顯著差異，其變化規律較為一致。蘋果、梨和桃果實酸性轉化酶的最適pH都在5左右，而中性轉化酶的最適pH在7左右。在金屬離子對轉化酶的影響方面，同種金屬離子對蘋果、梨和桃果實轉化酶活性的影響基本一致。Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+和Mn2+對酸性轉化酶活性有促進作用，表明這些金屬離子有利于維護酸性轉化酶的活性部位;而Mg2+，Zn2+和Cu2+卻均抑制可溶性中性轉化酶的活性[6]。對于轉化酶的最適反應溫度，蘋果、梨和桃的中性轉化酶均比酸性轉化酶高出10 ℃，因而可以認為，中性轉化酶和酸性轉化酶可能存在不同的活性調控的機制。另外，本試驗還表明，破壞巰基穩定性的Hg2+能完全抑制各種形態轉化酶的活性，由此表明，轉化酶的活性部位含有巰基基團，與前人的研究結果相一致[6]。

本研究利用蘋果、梨和桃果實轉化酶的粗提液對轉化酶的種類和特性進行了分析比較，發現，蘋果、梨和桃果實中均存在3種轉化酶，并且具有相似的特性。這使我們對果實轉化酶的理化特性有了初步的認識，為果實轉化酶的分離和純化提供了理論依據。

參考文獻:

[1] 呂英民，張大鵬.果實發育過程中糖的積累[J].植物生理學通訊， 2000， 36(3): 258-265.

[2] 陳俊偉，張良誠，張上隆.果實中糖的運輸、代謝與積累及其調控[J].植物生理與分子生物學報， 2004， 30(10): 1-10.

[3] Farrar J， Pollock C， allagher J. Sucrose and the integration of metabolism in vascular plants[J]. Plant Sci， 2000， 154: 1-l1.

[4] 王永章，張大鵬.紅富士蘋果果實蔗糖代謝與酸性轉化酶和蔗糖合酶關系的研究[J].園藝學報， 2001， 28(3): 259-261.

[5] 林玲，孫光明，李紹鵬，等.園藝植物果實中糖代謝的研究進展[J].華南熱帶農業大學學報， 2005， 11(4): 37-41.

[6] 潘秋紅， 張大鵬.植物轉化酶的種類、特性與功能[J].植物生理學通訊， 2004， 40(3): 275-280.

[7] Miron D， Schaffer A A. Sucrose phosphate synthase， sucrose synthase and invertase activities in developing fruit of Lycopersicon esculentum Mill. and the sucrose accumulating in Lycopersicon hirsutum Humb. and Bonp[J].Plant Physiol， 1991， 95: 623-627.

[8] Lee H-S， Sturm A. Purification and characterization of neutral and alkaline invertase from carrot[J].Plant Physiol，1996， 112: 1513-1522.

[9] Sturm A. Invertases primary structures， functions and roles in plant development and sucrose partitioning[J].Plant Physiol， 1999， 121: 1-7.

[10] 李肖蕖，王建設，張根發.植物蔗糖轉化酶及其基因表達調控研究進展[J].園藝學報， 2008， 35(9): 1384-1392.

[11] Miller E M， Chourey P S. The maize invertase-deficient miniature-l seed mutant is associated with aberrant pedicel and endosperm development[J]. Plant Cell， 1992(4): 297-305.

[12] Hedley P E， Maddison A L， Davison D， et al. Diferential expression of invertase genes in internal and external phloem tissues of potato[J]. J Exp Bot， 2000， 51: 817-821.

[13] Yamaki S. Physiology and metabolism and compartment. biochemistry of sugar metabolism and compartmentation in fruit[J]. Acta Hort， 1995， 398: 109-120.

[14] 蘇艷，原牡丹，侯智霞，等.蔗糖代謝相關酶在果實中的作用[J].北方園藝，2008(9): 50-54.