蘋果屬四倍性皺葉矮生株系小孢子敗育過程的解剖觀察

摘 要：為了研究平邑甜茶與扎矮山定子雜交后代中四倍性皺葉矮生株系10#和23#植株的雄性不育表現和細胞學特征，在觀測花朵形態基礎上，采用石蠟切片法顯微觀察了四倍性皺葉矮生株系及父本扎矮山定子(對照)的小孢子發生和敗育過程。結果表明，10#和23#株系能產生雄蕊，但在初花期就出現花藥干癟現象，也沒有顯現花粉。顯微觀察發現：10#和23#株系在小孢子母細胞的形態特征和發育過程上與對照沒有明顯區別，它們的小孢子母細胞也能進行減數分裂并形成形態正常的二分體和四分體，但未能形成單核花粉粒；到開花前它們的花藥均表現空蠼現象；因此，10#和23#株系的小孢子敗育時期是在四分體到單核花粉粒期間。

關鍵詞：蘋果屬；四倍性皺葉矮生株系；小孢子敗育；解剖觀察

中圖分類號：S661.1 文獻標識碼：A 文章編號： 1009—9980f2010)04—490—06

世界上公認的蘋果屬植物多達36種。中國是蘋果屬植物重要起源地之一。平邑甜茶〔Malus hupe-hensis (Pamp.) Rehd.var.pingyiensis Jiang〕為湖北海棠的一個變種，原產于我國山東省平邑縣，具有非常強的無融合生殖能力，其無融合生殖率超過95％，樹性喬化，耐陰、抗澇能力強，嫁接蘋果的親和力強，是目前蘋果生產中已被廣泛應用的喬化砧木之一。扎矮山定子〔M.baccata (L.) Borkh.cv.zha’ai Shandingzi〕發現于內蒙古自治區呼倫貝爾盟扎蘭屯，是普通山定子的矮生型突變，在與普通山定子或蘋果品種的雜交后代中高株與矮株比例為1:1，并可以保持高抗寒性。董文軒等以平邑甜茶為母本與扎矮山定子雜交，共獲得100多株有性雜交后代，絕大多數為四倍性植株，其四倍性來源為三倍體平邑甜茶未經減數分裂的3x染色體加上二倍體扎矮山定子經過減數分裂所提供的1x染色體。王穎等對部分四倍性植株的胚胎發育過程進行了顯微觀察并發現了少數多胚囊現象，但對這些株系小孢子發育過程及敗育機理的研究尚未進行。因此我們從四倍性皺葉矮生后代中選取2株表現為皺葉矮生特性的株系為試材，以雄性可育的扎矮山定子父本為對照，對其小孢子的發育過程及敗育特征進行了顯微觀察和研究，為揭示它的小孢子敗育機理提供解剖學依據，也為進行分子生物學研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

材料選用沈陽農業大學蘋果育種基地的平邑甜茶與扎矮山定子雜交后代中四倍性皺葉矮生株系成齡樹10#和23#植株的花芽和花朵；對照為二倍性扎矮山定子(父本)的花芽和花朵。

從2009年4月初開始，每隔2d取樣1次直至開花期(5月5日左右)，每次取6～7個花蕾(芽)或2～3個花序，放入潔凈的青霉素小瓶中，用改良FAA固定液(70％酒精：福爾馬林：冰醋酸=90:5:5，再加入5mL純甘油)固定并保存。

在各試材的初花期，采集四倍性皺葉矮生株系及其對照扎矮山定子即將開放的大花蕾或初開花朵各50個觀察花器官特征并照相記錄，然后隨機選取20朵花用游標卡尺測量花器大小，取平均值，同時調查單個花朵的花藥數。

石蠟切片采用李正理的方法。每份試材取3～4個花蕾或花芽，切片厚度10～12μm。采用鐵礬一蘇木精媒染法，并用2.0％鐵礬溶液分色，經再度脫水后，用加拿大樹膠封片。用Olympus顯微鏡觀察、照相。

2 結果與分析

2.1 四倍性皺葉矮生株系花器官的形態特征

表1結果表明，四倍性皺葉矮生株系10#和23#花朵橫徑和單花花藥數比對照扎矮山定子的小，但花瓣長寬與對照差別不明顯。在開花當天對四倍性皺葉矮生株系和扎矮山定子植株花器官特征進行仔細調查發現，扎矮山定子植株花藥飽滿，顏色為鮮艷的淡黃色(圖版1-1)，而四倍性皺葉矮生株系的花藥干癟且顏色較深(圖版1-2～3)；將四倍性皺葉矮生株系和對照的鮮花藥分別取回實驗室，陰干后用手指輕捻，發現扎矮山定子明顯有花粉出現，而四倍性皺葉矮生株系未發現有花粉散出。此外，在花器官發育進程上四倍性皺葉矮生株系比扎矮山定子要晚3～4d。

2.2 四倍性皺葉矮生株系小孢子發育和敗育過程的顯微觀察

扎矮山定子和四倍性皺葉矮生株系每朵花均含有多枚雄蕊，每個花藥的發育進程并不一致甚至每個藥囊中小孢子的發育程度也不一致。4月5日，扎矮山定子植株形成造孢細胞，造孢細胞的細胞核較大，能明顯看到里面的核仁，細胞間排列緊密，此時無法辨別花藥內的中層細胞、絨氈層細胞和小孢子母細胞(圖版1—4)。4月9日，四倍性皺葉矮生株系形成造孢細胞，細胞的結構與對照沒有區別(圖版I—5～6)。4月9日左右，扎矮山定子在花藥囊內形成小孢子母細胞，這些細胞排列緊密，呈多角形，有明顯的細胞核，核仁較大(圖版1—7)。4月13日左右，四倍性皺葉矮生株系花藥囊內的造孢細胞經過幾次分裂。形成小孢子母細胞。此時，由于細胞的旺盛分裂和體積的擴大，花藥橫切面呈明顯的蝶形。四倍性皺葉矮生株系小孢子母細胞排列緊密，細胞核明顯，核仁較大，能明顯的分辨出藥壁細胞、2～3層中層細-胞、一層絨氈層細胞和小孢子母細胞，絨氈層細胞較大、為多核，細胞質均勻(圖版1—8～9)。據觀察四倍-性皺葉矮生株系小孢子母細胞的形態特征與對照扎矮山定子沒有差別。小孢子母細胞繼續發育，細胞變大、變圓，細胞間隙擴大，細胞核、核仁變大，細胞核內形成大量染色質，并進一步分化形成細線狀，此時小孢子母細胞進入減數分裂期，此時期四倍性皺葉矮生株系與對照未見差別(圖版1—10～12)。在4月-15日左右，扎矮山定子小孢子母細胞進行減數分裂，先形成二分體，細胞形狀呈橢圓形，染色體向細胞兩極運動，絨氈層結構完整(圖版Ⅱ—1)；4月19日，四倍性皺葉矮生株系小孢子母細胞形成二分體，二分體形態和結構與對照基本相同(圖版Ⅱ—2～3)，但通過圖版Ⅱ—2看出此時四倍性皺葉矮生株系花藥囊中的絨氈層結構開始解體。4月17日，扎矮山定子的二分體再次分裂形成四分體，并表現為同時型胞質分裂方式，四分體成正四面體結構，通常在一個平面內只能觀察到3個細胞；此時的絨氈層細胞排列疏松但結構完整(圖版Ⅱ—4)。4月21日左右，四倍性皺葉矮生株系經過減數分裂過程也形成四分體，四分體排列方式與對照相同。形態結構與對照也未見明顯差別，但花藥囊內的絨氈層細胞此時已完全解體，未看到形態結構完整的絨氈層細胞(圖版Ⅱ—5～6)。4月21日左右，扎矮山定子植株的四分體進-人分離前期，剛分離出來的四分體細胞形態結構不規則、呈多角形，并能觀察到明顯的萌發溝。細胞核和核仁明顯(圖版Ⅱ—7)。單核花粉粒經過一次核分裂形成雙核花粉粒，在細胞內能明顯看到2個大小不一致的細胞核(圖版Ⅱ—8)。雙核花粉粒積累營養物質，染色較深；此時絨氈層細胞顯著解體，核消失，內含物消失殆盡，僅剩下很薄的一層殘留物(圖版Ⅱ—9)。4月27日左右，扎矮山定子植株花粉粒成熟，絨氈層此時徹底消失，相鄰的兩個藥室相通，形成花藥的開裂線，準備散粉(圖版Ⅱ—10)，此時距開花期還有1周左右的時間。四倍性皺葉矮生株系雖然存在四分體結構但未發現有單核花粉粒出現，之后迅速解體、表現為花藥空囊(圖版Ⅱ—11～12)；雖然，藥室壁可以正常加厚、也有開裂線存在、而且花藥也可以正常開裂，但沒有任何花粉粒存在。這一時期出現在花前1周即4月29日左右。

3 討論

針對果樹雄性不育發生機理和時期的研究已有很多報道，主要集中在解剖學、胚胎學、細胞生物學、生物化學和分子生物學等方面。在細胞生物學上普遍認為絨氈層發育不正常和減數分裂異常是導致果樹雄性不育的主要原因。

很多研究表明花粉敗育是因為絨氈層表現異常，即絨氈層細胞在花粉形成和發育過程中過度肥大、液泡化、提前或延遲退化。何天明等在對新梨7號以及羅來水等對桃的23個品種的花粉敗育過程的研究發現，小孢子敗育與花藥壁絨氈層細胞在發育后期增大、液泡化有關。郭艷玲等㈣在新高梨和愛宕梨雄性不育的細胞學研究中也發現，小孢子敗育可能與絨氈層提前解體有關。四倍性皺葉矮生株系的絨氈層屬于腺質絨氈層或稱分泌絨氈層：它的絨氈層在二分體時期開始解體，到四分體時期完全解體、幾乎沒有發現結構完整的絨氈層細胞：而此時對照的絨氈層及其細胞的結構仍然基本完整，說明四倍性皺葉矮生株系的絨氈層發生了提前解體。我們認為絨氈層細胞的提前解體是四倍性皺葉矮生株系小孢子敗育的主要原因，而絨氈層提前解體一般會導致不能提供小孢子發育后期所需要的營養物質。但導致絨氈層提前解體的原因還有待進一步研究。

減數分裂過程的異常是果樹雄性不育的另一個重要原因。Kobeltl為三倍體洋梨花粉的敗育是由減數分裂不正常引起的，石蔭坪等舊在三倍體伏花皮蘋果和王強生等在四倍體大鴨梨上也有類似報道。但四倍性皺葉矮生株系的小孢子母細胞與對照相比形態結構正常，能形成形態正常的二分體和四分體，因而從形態上推測四倍性皺葉矮生株系的減數分裂行為正常，不會造成小孢子的敗育。

在敗育時期上，Laser等㈣指出雄性不育花藥的敗育可以發生在小孢子發育的任何時期，雙子葉植物多發生在四分體形成之前，即在減數分裂末期不能形成細胞板，因而不能形成四分孢子，會始終以多核細胞存在。王玖瑞等研究發現棗樹的雄性不育材料，雄性不育1號花粉敗育時期在四分體之后。四倍性皺葉矮生株系具體的敗育時期是在四分體后，單核花粉粒之前。這與董紹珍等在湖北海棠上的研究結果一致。

此外，王穎等曾采用與本研究相似的四倍性皺葉矮生株系為試材，研究了胚胎發育特征，并認為四倍性皺葉矮生株系的無融合生殖能力很弱、以有性生殖為主；本研究進一步發現這些四倍性皺葉矮生株系在小孢子上表現為完全敗育，沒有花粉粒：但董紹珍等在對湖北海棠等21份試材的研究發現，沒有花粉是表現與無融合生殖相關的性狀之一。由此看出，在四倍性皺葉矮生株系上無花粉并沒有表現出是無融合生殖的相關性狀，造成這種現象的原因還有待進一步探討。

4 結論

四倍性皺葉矮生株系花器官形態正常，能產生雄蕊，但花藥在初花期即干癟萎縮，不能產生花粉。四倍性皺葉矮生株系小孢子母細胞能進行減數分裂形成四分體。四倍性皺葉矮生株系小孢子敗育的主要時期在四分體到單核花粉粒時期。四倍性皺葉矮生株系在二分體時期絨氈層開始解體，在四分體時期完全破裂、解體，沒有結構正常的絨氈層細胞：由此認為四倍性皺葉矮生株系小孢子敗育的主要原因是絨氈層細胞的提前解體。